Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
каплю конъюгата и помещают на 15-20 мин в термостат при 37° С. Меченные
флюорохромом антитела (конъюгат) взаимодействуют с антигеном - клетками
гриба с образованием комплекса антиген - антитело, флюоресцирующего в УФ-
свете. Избыток конъюгата необходимо смывать в течение 15 мин забуференным
физиологическим раствором, который состоит из 1 части 0,15 М фосфатного
буфера (pH 7,2-7,4) и 9 частей 0,85%-ного раствора NaCl, а затем
сполоснуть водой. После просушивания на воздухе или в термостате
препараты исследуют под микроскопом МЛ или МБИ-1, снабженным
люминесцентным устройством ОИ-17 со светофильтрами СФ-1 и СЗС-7 или СЗС-
14; окуляр - ЖС-3.
При окраске препарата непрямым методом на поверхность мазка наносят каплю
иммунной кроличьей сыворотки или глобулина. При этом антитела сыворотки
взаимодействуют с антигеном, образуется несветящийся комплекс антиген -
антитело. После 30 мин инкубации при 37° С во влажной камере избыток
сыворотки смывают забуференным физиологическим раствором, просушивают на
воздухе и наносят каплю меченной флюорохромом антикроличьей сыворотки на
15-25 мин. Сыворотка взаимодействует с кроличьим иммунным глобулином,
адсорбированным на клетках грибов, образуя светящийся комплекс. Приемы
микроскопии такие же, как и в прямом методе.
XVII.9.8. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК
Серологические реакции используются для идентификации грибных культур,
выделенных от больных и из внешней среды. Для этого необходимы
специфические сыворотки высокого титра, получаемые от кроликов,
иммунизированных соответствующими культурами патогенных и условно-
патогенных грибов, а также продуценты различных биопрепаратов. Антигеном
для иммунизации служит гомогенная взвесь из агаровой культуры гриба в
физиологическом растворе. Более быстрое накопление антител наблюдается
при более частом введении антигена (через 3-4 дня). Наиболее высокие
титры антител достигаются в результате 2-3 привирочных циклов с 10-15-
дневными интервалами между ними. Через 10 дней после окончания вакцинации
из краевой вены уха кролика берут кровь, специфическую активность и титры
которой устанавливают в серологических реакциях,
410
Для выявления грибкового антигена в крови больных и переболевших
используют РСК на холоду, при температуре 3-5° С; специфическая иммунная
сыворотка для этого берется в разведении 1:5 - 1 : 10, а исследуемая от
больного - в разведении 1 : 3.
XVII.10. АНТИГЕНЫ
Антигены являются вторым необходимым компонентом серологических реакций и
аллергических проб. Они бывают корпускулярные (взвесь убитых клеток
грибов) и растворимые (вытяжки полисахаридной, белковой или комплексной
природы). Антигены получают из зрелых, но не старых культур
дрожжеподобных (5-7-дневных) и ми-целиальных (15-20-дневных) грибов,
выращенных поверхностным способом на подходящих плотных или жидких
питательных средах в
7
Рис. 127. Схема лабораторной установки для культивирования
грибов (- ферментирование; - • -засев;-----------взятие пробы):
1 - бактерицидные лампы; 2 - позиционное реле; 3 - компрессор для
нагнетания воздуха; 4 - ловушка с. ватой для притекаемого воздуха;
5, 6 - ловушки, заполненные растворами фенола и щелочи соответственно; .
7 - фильтры; 8 - сосуд для отбираемых проб; 9 - ловушка; 10 - ферментер,
помещенный на водяную баню; 11 - ультратермостат;
12 -ловушка для пены.
стеклянных матрасах емкостью 0,5 1,5; 2 л при оптимальной для развития
температуре (25 или 37° С) или погруженным способом.
При погруженном выращивании развитие грибов происходит в 2-3 раза
быстрее, урожай (грибница) в 2-3 раза выше; при этом антигенные свойства
и специфичность грибов в соответствующих реакциях сохраняются.
Показателями оптимальной пригодности грибов для получения соответствующих
антигенов считаются интенсивность их споруляции, кони-диальное
размножение характерной формы и размеров, наличие почкующихся форм
дрожжеподобных грибов при незначительном содержании старых, богатых
липидами клеток [149, 199, 200, 202].
411
Для накопления биомассы дрожжеподобных и мицелиальных грибов погруженным
методом в&ращивания пригодной оказалась лабораторная установка М. П.
Нефедова, А. П. Кашкина (рис. 127), состоящая из сосуда для
культивирования - ферментера (10) - стеклянной бутыли емкостью 20 л,
заполненной на 2/3 питательной средой. Бутыль герметически закрыта
резиновой пробкой, через которую пропущены барботер (Г-образная трубка из
нержавеющей стали с рядом отверстий 1,0-1,5 мм) и трубка для отвода
избыточного давления. Воздух нагнетается компрессором (3) и поступает
последовательно в ловушку с ватой (4) и ловушки (5 и 6)у заполненные 5%-
ным раствором фенола и 30%-ным раствором щелочи соответственно, и далее
через фильтры (7) и ферментер (70).Для обеспечения стерильных условий в
помещении с установкой для культивирования имеются бактерицидные лампы
БУВ-15 (7), режим работы которых задают с помощью позиционного реле (2).
Воздух, выходящий из ферментера, последовательно проходит через ловушку
