Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
нескольким клонам паразита.
Преимущество техники отсеченных листьев заключается и в том, что
растения, используемые для анализа, сохраняют способность к репродукции.
Растения выращивают в сосудах с нормальной для репродукции плотностью;
через 5 дней после появления всходов их нумеруют и отрезают от каждого по
половине первого листа для анализа. При этом уже в F2 можно выделить
растения, имеющие только один ген устойчивости из двух, что важно для
получения серий моногенных линий, а также растения, сочетающие оба гена
устойчивости, что используется в селекционных целях.
XV.7.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ
Идентифицировать ген устойчивости - значит определить его тождество или
отличие от ранее известных генов устойчивости, включенных в генетические
серии, подобные серии Thatcher, а также выявить его аллельные отношения с
уже известными генами устойчивости. Для преодоления разных аллелей одного
локуса, контролирующего устойчивость хозяина, паразиту требуются разные,
чаще всего независимые, гены вирулентности. В этом смысле разные аллели
одного локуса ведут себя так, как если бы это были разные гены
устойчивости. Поэтому отличия, устанавливаемые с помощью
фитопатологических тестов, не дают информации об аллельных отношениях
изучаемого гена с ранее известными. Об аллелизме, или сцепленности, можно
судить только по результатам анализа гибридов.
XV.7.3.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ОТЛИЧИЙ ОТ ИЗВЕСТНЫХ ГЕНОВ
УСТОЙЧИВОСТИ ПО ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКИМ ТЕСТАМ
В условиях приведенного эксперимента нетрудно исключить ответственность
уже известных генов серии Thatcher за устойчивость изучаемого сорта. Для
этого достаточно показать отличие спектра его реакций устойчивости к
набору клонов гриба от реакций изогенных линий. Большинство клонов
возбудителя бурой ржавчины, составляющих природные популяции,
универсально вирулентны, т. е. вирулентны ко всем генам, входящим в серию
Thatcher, кроме Lr9 и Lr 19. Если сорт устойчив к таким клонам, значит
защищающий его ген не может быть тождественным ни одному из известных
генов, кроме, возможно, Lr9 и Lr 19. Подобрать клоны, вирулентные к Lr9 и
Lr 19, практически невозможно. Значительно проще найти клоны, вирулентные
к изучаемым сортам.
373
Процедура выделения таких клонов описана в разделе XV.5.1. Если эти клоны
окажутся ^вирулентными к линиям Thatcher Lr9 и L/T9, то можно считать
доказанным, что изучаемый сорт защищен геном, отличным от Lr9 и Lr 19.
После того как доказано отличие изучаемого гена от известных, остается
выяснить его аллельные отношения с ними.
XV.7.3.2. УСТАНОВЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ
С ИЗВЕСТНЫМИ ГЕНАМИ УСТОЙЧИВОСТИ
Известно, что гены устойчивости часто образуют аллельные серии и
сцепленные блоки. Изучаемый ген устойчивости может оказаться известным
ранее аллельным состоянием одного из генов, имеющихся в серии Thatcher,
или может быть с ним сцеплен. В таком случае его можно локализовать, не
прибегая к анеуплоидному анализу. Для этого скрещивают изучаемый сорт и
линии серии Thatcher, несущие известные гены, и затем по расщеплению в F2
судят об аллельности или сцеп-ленности с каким-либо из этих генов.
Тест-клоны для анализа F2 должны быть авирулентными к обоим компонентам
скрещивания: к устойчивому сорту и к соответствующей линии Thatcher.
Главная трудность состоит в подборе клонов, авирулент-ных к линиям
Thatcher, так как такие клоны в наших популяциях встречаются с частотой
менее 1%. Чтобы отыскать эти клоны можно пользоваться упрощенным клоновым
анализом популяций гриба.
XV.7.3.3. УПРОЩЕННЫЙ ВАРИАНТ КЛОНОВОГО АНАЛИЗА ПОПУЛЯЦИЙ
ГРИБА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛОНОВ С РЕДКИМИ АЛЛЕЛЯМИ
АВИРУЛЕНТНОСТИ
Методика выделения клонов гриба с редкой вирулентностью описана в разделе
XV.5.1. Однако она непригодна для выделения клонов с противоположной
характеристикой, для которых не существует селективных Я1>ед. В таком
случае поступают следующим образом. Суспензией спор природной популяции
низкой концентрации заражают газоны из листьев чувствительного сорта (см.
раздел XV.3.1) или чашки Петри, используемые для размножения
инфекционного материала (см. раздел
XV.3.3). Через 8-9 дней после заражения, когда разовьются пустулы,
готовят кюветы для анализа. Для этого в кювету на слой ваты, смоченной
бензимидазолом, раскладывают парами отрезки листьев. В каждую пару входит
отрезок линии, к которой нужно отыскать авирулентный клон, и отрезок
чувствительного контроля. Длина отрезков около 1 см. Чтобы их не
смешивать, отрезки чувствительного сорта можно сделать длиннее - около
1,5 см. По два отрезка кладут вплотную друг к другу; отрезок линии
располагают всегда слева, отрезок контроля всегда справа. Расстояние
между парами в ряду, а также между рядами по вертикали около 0,5 см.
Подготовленные таким образом отрезки листьев в кюветах обильно
опрыскивают водой из пульверизатора и приступают к заражению.
Микробиологическую иглу прокаливают на спиртовке, охлаждают в чашке Петри
с водой и переносят споры из хорошо развитой и одиночно расположенной
