Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
можно выделить три основных типа тетрад:
ЛВ, ЛВ, ЛВ, ЛВ, ab, ab, аЪ, ab - родительский дитип (р);
Ab, Ab, Ab, АЬ, аВ, аВ, аВ, аВ - неродительский дитип (нр);
AB, АВ, Ab, АЪ, аВ, аВ, ab, ab - тетратип (т).
Если гены Л, а и В, b сцеплены, т. е. расположены в одной хромосоме, то
родительский дитип тетрад возникает при отсутствии кроссинговера между
генами Л и В, а неродительский дитип и тетратип являются результатом
кроссинговера. Если гены Л и В расположены в разных хромосомах и
достаточно удалены от центромер, то вероятность появления родительских и
неродительских типов составит по 1/6, а тетратипа 2/3, т. е. соотношение
р : нр : т равно 1:1:4. Данное расщепление указывает на то, что
скрещиваемые родительские формы отличаются друг от друга по двум
несцепленным генам, а также на отсутствие взаимодействия генов.
Отклонение от этого соотношения свидетельствует об обратном. Для
детального ознакомления с теорией тетрадного анализа рекомендуем
обратиться к соответствующим руководствам [169, 170, 171].
354
XIV.3.2. АНАЛИЗ ГИБРИДОВ ПРИ БЕСПОЛОМ РАЗМНОЖЕНИИ
Для проведения гибридологического анализа грибов, в жизненном цикле
которых отсутствует половой процесс, необходимо осуществить синтез
гетерокарионов, получить из них гетерозиготные диплоиды, выделить и
идентифицировать сегреганты, появляющиеся в результате митотического
расщепления диплоида.
XIV.3.2.1. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОКАРИОТИЧНЫХ ФОРМ
Для получения гетерокарионов необходимо использовать генетически
маркированные штаммы. Маркерами могут служить мутанты по морфологическим,
физиологическим и биохимическим признакам. Наиболее ценны ауксотрофные
мутанты. Каждый из них в отдельности не растет на среде минимального
состава; рост наблюдается только в случае появления гетерокариотических
гиф.
Существует несколько способов получения гетерокарионов. Можно провести
посев штрихами на питательную среду смешанной суспензии двух штаммов или
нанести штрихами перпендикулярно друг другу суспензии разных штаммов. При
появлении секторов или обильного роста в местах перекреста штрихов их
следует изолировать и отселектиро-вать. Если исходные штаммы несли
мутации ауксотрофности, т. е. не могли расти на минимальной среде, то
гетерокариотические гифы являются прототрофами и могут быть
отселектированы на среде минимального состава.
Другой способ - посев разных штаммов "блоками" [746]. При этом от колоний
исходных штаммов отсекают маленькие кусочки агара с грибом и располагают
их парами на среде. Блоки обрастают гетеро-кариотическим мицелием,
который отделяют и высевают на селективную среду.
Гетерокарионы можно получить и в жидкой питательной среде. Хасти [612]
рекомендует приготовить суспензии двух родительских штаммов в жидкой
среде полного состава, а затем капли суспензии нанести на дно чашки Петри
и инкубировать 30 ч при оптимальной температуре. Образовавшиеся в каплях
комки мицелия следует промыть в стерильной дистиллированной воде и
перенести на селективную среду. Можно засеять смесью штаммов пробирки с
жидкой средой, получить мицелиальную пленку, отмыть ее в стерильной воде
и посеять маленькими кусочками на селективную среду.
XIV.3.2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДИПЛОИДОВ
В результате случайного слияния двух разных ядер в мицелии ге-терокариона
с очень низкой частотой могут возникать гетерозиготные диплоидные
конидии. В отличие от конидий гетерокариона, диплоидные споры растут на
минимальной среде. Поэтому посевом большого количества конидий
гетерокариона можно отобрать на селективной среде спонтанно возникшие
диплоидные клетки. Кроме того, можно индуцировать диплоидизацию ядер в
гетерокариотическом мицелии воздействием повышенной температуры [746],
обработкой камфорой [757] или УФ-лучами [631].
12*
355
XIV.3.2.3. ОТБОР PFKOMBHHAHTOB
При высокой спонтанной частоте выщепления рекомбинантов у ди-плоидов
конидиальную суспензию высевают на среду полного состава и делают
отпечатки с помощью бархата или репликатором на ряд селективных сред. При
низкой частоте выщепления сегрегантов митотическую рекомбинацию можно
индуцировать облучением суспензии диплоидных спор рекомбиногенными дозами
УФ-лучей или воздействием аналога фенилаланина - парафторфенилаланином.
XIV.3.2.4. АНАЛИЗ МИТОТИЧЕСКОЙ РЕКОМБИНАЦИИ
Подробно методы анализа митотической рекомбинации рассматриваются в
работах С. В. Каменевой [188, 190]. Мы остановимся лишь на основных
моментах данного анализа.
В основе митотического расщепления лежат два независимых процесса:
гаплоидизация и митотический кроссинговер. При гаплоидиза-ции, вследствие
случайной утраты одной из каждой пары гомологичных
Хромоты
исходной.
клетки
Профаза
ABC Р0Е
-¦-п.,, 'Q-*
abode.
А ВОРЕ
ТУ В С D Е
аКь с d е
Анасраза
Генотипы
дочерних
клеток
abode Рис. 120. Схема митотического кроссинговера.
АА BbCcBdEe , -aaBbCcBd.Ee или %
AdBbCcDdEe , AaBbCcBdEe
хромосом, из диплоидной клетки выщепляются сегреганты с гаплоидным
набором хромосом. Так, у диплоида с тремя парами гомологичных хромосом
