Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Более подробно с методами учета концентрации мутантов в популяции и
вероятности возникновения мутаций можно познакомиться в соответствующих
руководствах по генетике микроорганизмов [171, 172].
XIV.3. МЕТОДЫ ГИБРИДОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В основе гибридологического анализа лежит получение гибридов и изучение
характера расщепления в потомстве по какому-либо признаку. В результате
представляется возможным выяснить закономерности наследования признака,
детерминирован он ядром или цитоплазмой, определить число генов,
контролирующих изучаемый признак, расположение их в хромосомах. Методы
получения гибридов в значительной мере зависят от особенностей жизненных
циклов, половой дифференциации и системы несовместимости у грибов. У
гетероталлических видов половой процесс возможен только при
взаимодействии клеток разного типа спаривания; клетки гомоталлических
видов копулируют в любых комбинациях. Системы половой несовместимости у
грибов весьма разнообразны [184]. Для фикомицетов, сумчатых и ржавчинных
грибов характерна система несовместимости, контролируемая, в основном,
одним локусом с двумя аллелями; головневые могут иметь один или два локу-
са с множественными аллелями, контролирующими половую несовместимость.
Генетический анализ у грибов, в жизненном цикле которых отсутствует
половой процесс, основывается на данных анализа митотической
рекомбинации.
XIV.3.1. АНАЛИЗ ГИБРИДОВ ПРИ ПОЛОВОМ
РАЗМНОЖЕНИИ
Для проведения гибридологического анализа грибов, в жизненном цикле
которых известен половой процесс, необходимо получить гибриды, выделить
из них гибридное потомство и проанализировать его расщепление. Учет
расщепления основывается на данных тетрадного анализа или анализа
случайной выборки гаплоидных клеток - продуктов мейоза.
XIV.3.1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДОВ
Наиболее простой метод получения гибридов заключается в совместном
культивировании штаммов разного типа спаривания. При этом удобно
использовать генетически маркированные линии, что позволяет легко
отличить гибрид от родительских штаммов. Для некоторых видов (например,
Saccharomyces cerevisiae) достаточно провести посев на агаровую
питательную среду перекрещивающимися штрихами двух родительских штаммов,
чтобы в короткий срок получить в месте перекреста
351
гибрид. У других видов методы получения гибридов сложнее, и осуществить
гибридизацию можно на агаровых средах или на растительном материале. Так,
для получения сумчатой стадии Pyrenophora teres рекомендуется попарный
посев штаммов положительного (+) и отрицательного (-) типов спаривания на
синтетическую среду, содержащую в 1 л воды (г); 1 Са (N6)3)2} 0,25
K2HPO4J 0,25 MgSO^ 4 СаСОз*, следы FeSC^ и 20 агара. В среду вдавливают
автоклавированные семена ячменя или сорго. Засеянные среды инкубируют в
термостате при температуре 15° С и 16-часовом освещении. Перитеции с
асками и аскоспорами образуются через 2,5 мес [694]. Сумчатую стадию
этого гриба можно получить на стерильной соломе ячменя и на листьях
лимона [259]. Стебли ячменя или листья лимона раскладывают на несколько
слоев фильтровальной бумаги и автоклавируют. На их поверхность высевают
штаммы разного типа спаривания и культивируют в тех же температурном и
световом режимах до появления перитециев с асками. На стерильной соломе
можно получить и сумчатую стадию грибов рода Cochliobolus [802].
Гибриды головневых грибов получают в два этапа: сначала гаплоидные штаммы
разного типа спаривания выращивают на искусственной питательной среде, а
затем их совмещают на растении-хозяине. На последнем образуется дикарион
и формируются гибридные телиоспоры. У некоторых видов головневых грибов,
например у Ustilago maydis, U. hordei, дикарион можно получить, совмещая
штаммы разного типа спаривания на среде, содержащей 1% активированного
угля [561, 563].
Гибриды у облигатно паразитирующих грибов, например возбудителей ржавчины
злаков, получают непосредственно на растении. Если у возбудителя ржавчины
имеется промежуточный хозяин, то базидио-спорами заражают его листья и
получают спермогонии со спермациями положительного (+) и отрицательного
(-) типов спаривания. После этого переносят спермации из одних
спермогониев в другие (рис. 119). Слияние (+) спермациев с (-)
воспринимающими/ифами спермогония, или наоборот,^приводит к образованию
эцидий с дикариотическими эци-диоспорами. Последние заражают растение-
хозяин, что приводит к появлению уредий с дикариотическими уредоспорами.
На основном хозяине можно провести анализ дикариофазы. Эцидиоспоры и
уредоспоры могут вызывать появление дикариотических телиоспор. Перед
прорастанием два ядра в телиоспорах сливаются, что приводит к образованию
гибридного диплоида.
XIV.3.1.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ГИБРИДНОГО ПОТОМСТВА
Наиболее простой способ выделения гибридного потомства - тотальная
изоляция гаплоидных продуктов мейоза. В этом случае дальнейшему анализу
подвергается случайная выборка спор. У некоторых аскомицетов при
созревании асков аскоспоры "выстреливаются" из плодовых тел. Аскоспоры
