Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 171

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 165 166 167 168 169 170 < 171 > 172 173 174 175 176 177 .. 279 >> Следующая

на минимальную среду, в которую внесена целая группа аминокислот либо
витаминов, или азотистых оснований. Затем, установив в какой из этих
групп присутствует фактор роста, необходимый мутанту, проводят более
детальную идентификацию к каждому веществу этой группы.
Метод быстрой идентификации ауксотрофных мутантов предложен Р. Холлидеем
[622]. В 12 чашек Петри с минимальной средой добавляют по шесть ростовых
факторов в определенных сочетаниях (табл. 26). После засева среды
ауксотрофными мутантами оценивают их пищевые потребности с помощью
таблицы. Например, мутант с потребностью в аденине будет расти в 1-й и 7-
й чашках, рост метионинзависимого мутанта проявится в 4-й и 11-й чашках.
Известны модификации этого метода, различающиеся, в основном, сочетанием
ростовых факторов [242]. Однако метод Холлидея следовало бы использовать
лишь для первичной оценки потребностей ауксотрофов, так как не всегда
удается определить истинную потребность мутанта в ростовом факторе из-за
наличия комплекса веществ в одной чашке. Поэтому приходится дополнительно
проверять ауксстрофы посевом на минимальную питательную среду,
ограниченную одним веществом.
Для быстрого определения питательных потребностей большого числа мутантов
пользуются металлической чашкой с лунками и репликатором с таким же
количеством штырьков (рис. 117). В каждой лунке простери-лизованной чашки
готовится суспензия мутанта. Репликатор после стерилизации в спирте и над
пламенем горелки охлаждают в отдельной чашке с минимальной средой и
опускают в гнезда металлической чашки. Затем репликатор поднимают и капли
суспензии переносят на тестер-ные среды. Рост мутанта на минимальной
среде с добавкой ростового фактора указывает на его потребность именно в
данном веществе.
349
XIV.2.7. ОТБОР ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ МУТАНТОВ
Основной принцип отбора мутантов, устойчивых к токсическим веществам, или
мутантов по признаку вирулентности, заключается в посеве большой
популяции клеток на селективную питательную среду. Селектирующим агентом
служит фактор, по отношению к которому нужно получить мутанты (фунгицид,
антибиотик, сорт растения). Деление чувствительных к данному фактору
клеток подавляется, а устойчивые клетки продолжают размножаться.
Выделение мутантов, устойчивых к токсическим веществам, следует начинать
с определения концентрации, при которой выживают лишь отдельные клетки
гриба. Для этого готовят твердую питательную среду с градиентом
концентрации ингибитора. Способ приготовления заключается в следующем.
Теплую агаровую среду выливают в чашки Петри и ставят ее наклонно, чтобы
получился скошенный слой агара. После затвердения среды чашку
устанавливают горизонтально и наливают второй слой агара вместе с
токсическим веществом. В результате диффузии токсического вещества в
нижний слой агара концентрация его становится пропорциональной толщине
питательной среды. Получив линейный градиент концентрации ингибитора,
засевают среду густой суспензией спор гриба. Колонии образуются
неравномерно. В местах наиболее высокой концентрации ингибитора вырастают
лишь единичные колонии, вероятно, клоны устойчивых мутантов. Их выделяют
и пересевают на среды с более высокой концентрацией токсического
вещества. Последовательно увеличивая концентрации ингибитора в
питательной среде, можно отобрать мутанты с очень высоким уровнем
устойчивости.
Отбор мутантов по признаку вирулентности проводят инокуляцией споровой
суспензией гриба иммунных сортов растения-хозяина. Целесообразно
использовать в работе штаммы, дополнительно маркированные по какому-либо
признаку, например отличающиеся от исходного типа цветом спор.
Возникновение на иммунном сорте симптомов поражения указывает на
появление вирулентных мутантов.
Увеличение выхода физиологических мутантов можно индуцировать обработкой
спор мутагенными факторами.
XIY.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТЫ ПОЯВЛЕНИЯ МУТАНТОВ
Летальный и мутагенный эффект физических и химических факторов учитывают
по выживаемости клеток грибов после обработки и количеству возникающих
мутаций. На основании этих данных строят графики зависимости выживаемости
и частоты мутаций от дозы мутагена. По оси абсцисс откладывают дозы или
экспозиции воздействия мутагеном, а по оси ординат - логарифмы процента
выживаемости и частоту мутаций (рис. 118).
Рис. 118. Зависимость выживаемости конидий (1) и частоты появления
морфологических мутантов (2) у Pullularia pullulans от дозы УФ-облучения;
мощность дозы - 51 эрг/с на 1 мм2.
350
Частоту появления морфологических мутантов рассчитывают по формуле г =
M/N, где М - число мутантных колоний; N -общее число выросших колоний.
При учете мутаций на селективной среде частоту встречаемости мутантов
определяют как отношение числа выросших на данной среде мутантных колоний
(М) к общему числу колоний, выросших на неселективной среде (N) с учетом
разведений исходной суспензии (/?). Таким образом, частота мутаций
определяется формулой г = М / pN.
Предыдущая << 1 .. 165 166 167 168 169 170 < 171 > 172 173 174 175 176 177 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed