Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
чашке, необходимо вносить в питательную среду вещества, оказывающие
параморфный эффект (натриевую соль дезоксихолиевой кислоты, свекловичный
пектин, медицинскую желчь и др.). В исследованиях с фитопатогенными
грибами приходится в некоторых случаях высевать обработанную мутагеном
суспензию непосредственно на растение-хозяин. Известны лабораторные
методы, позволяющие проводить рассев большой популяции клеток на
изолированные листья растений [14, 310].
Листья проростков растений раскладывают в чашки Петри сплошным газоном и
опрыскивают мерным количеством споровой суспензии определенной
концентрации. В течение суток чашки экспонируют на рассеянном свету.
Затем на дно чашек наливают 10-15 мл 0,004%-ного раствора бензимидазола,
что поддерживает метаболизм в тканях листьев, сохраняя их зелеными. После
этого чашки помещают в установку, оснащенную лампами дневного света с
интенсивностью освещения около 3000 лк. Этот метод особенно удобен для
генетического изучения облигатных паразитов и для тестирования клонов по
признаку вирулентности. Таким образом, представляется возможным
непосредственно на листьях растений учитывать летальное и мутагенное
действие различных факторов и проводить отбор мутантов. Следует при этом
иметь в виду, что данные по выживаемости и частоте мутаций на листьях
растений могут отличаться от данных, получаемых на агаровых питательных
средах.
XIV.2.4. ОТБОР МОРФОЛОГИЧЕСКИХ МУТАНТОВ
Выявление мутантов с измененной морфологией колоний, конидиеносцев или
конидий не представляет особых трудностей. Внешние различия в морфологии
колоний легко обнаружить невооруженным глазом, а для более тонких
исследований можно воспользоваться микроскопом. Все выросшие колонии
просматривают и выделяют резко отличающиеся от исходного типа. Для многих
видов характерно появление колоний с измененным цветом или выделяющих в
среду пигмент, интенсивно спороносящих или аспорогенных, складчатых или
морщинистых.
XIY.2.5. ОТБОР БИОХИМИЧЕСКИХ МУТАНТОВ
Принцип отбора биохимических мутантов заключается в том, что в силу
нарушения синтеза какого-либо компонента внутриклеточного обмена мутанты
не могут расти на среде, не содержащей этого компонента. В отличие от них
клетки дикого типа (прототрофы) размножаются без дополнительного фактора
роста. Исходя из этого суспензию клеток, обработанных мутагеном, высевают
на питательную среду, обогащенную аминокислотами, витаминами и азотистыми
основаниями (среда полного состава). Для выделения ауксотрофных мутантов
Колонии, выросшие на среде полного состава, необходимо перенести на среду
мини-
347
Рис. 116. Отбор ауксотрофных мутантов методом отпечатков:
/ - колонии на полной среде; 2 - отпечаток колоний на бархате; 3,4 -
отпечатки колоний с бархата на минимальную и полную среды; 5,6 -
ауксотрофные мутанты.
мального состава, т. е. не содержащую факторов роста. Колонии, не
растущие на минимальной питательной среде, считаются ауксотрофными
мутантами.
Перенос колоний с одной среды на другую можно осуществить методом
отпечатков. Для этого к поверхности колоний, выросших на полной
питательной среде в чашках Петри, прикладывают стерильный бархат, а затем
этот же бархат прикладывают к поверхности минимальной или иной тестерной
среды в другой чашке Петри (рис. 116). При работе с грибами, образующими
воздушный мицелий, пользуются специальными репликаторами [834]. В связи с
отсутствием в минимальной среде аминокислот, витаминов и азотистых
оснований, клетки, не способные самостоятельно синтезировать эти
вещества, т. е. ауксотрофные мутанты, не размножаются. Идентичные им
колонии выделяют со среды полного состава и после повторной проверки на
ауксотрофность идентифицируют на установление специфической потребности в
ростовом факторе. Известны и другие методики отбора ауксотрофных
мутантов: использование антибиотиков, задерживающих рост прототрофных
клеток, метод замедленного обогащения среды и др. [3, 78].
XIY.2.6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АУКСОТРОФНЫХ МУТАНТОВ
Обычно ауксотрофные мутанты идентифицируют по потребности в
аминокислотах, витаминах и азотистых основаниях. Аминокислоты и азотистые
основания добавляют в минимальную среду в количестве
Рис. 117. Металлическая чашка с репликатором для идентификации
ауксотрофных мутантов.
348
Таблица 26. Сочетание ростовых факторов для идентификации ауксотрофных
мутантов
Номер чашки
Номер чашки 1 2 3 4 б
7 Аденин Биотин Фенил- аланин Аланин Аргинин
Лейцин
8 Гипо- ксантин Фолиевая кислота Серии Цистеин Орнитин
Глицин
9 Цитозин Пантотено-вая кислота Триптофан Треонин Аспара-
гиновая кислота Изолей- цин
10 Г уанин Пиридоксин Тирозин Тио- сульфат Метио- нин
Пролин Гистидин
11 Тимин Тиамин Параамино- бензойная кислота Глутами- новая
кислота Лизин
12 Тиамин Рибофлавин Никотиновая кислота Холин Инозит Валин
10, витамины - 1 мкг/мл среды. Методические подходы к определению пищевых
потребностей могут быть различными. Один из них состоит в высеве мутантов
