Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
питательных средах и за короткий промежуток времени воспроизводят большое
число генераций. В жизненном цикле некоторых грибов имеется половой
процесс, что позволяет осуществлять гибридизацию, а в потомстве
анализировать непосредственно продукты мейоза. Для видов, лишенных
полового процесса, разработаны методы анализа митотической рекомбинации.
У грибов можно относительно легко индуцировать мутагенными факторами
самые разнообразные морфологические, биохимические и физиологические
мутанты. Таким образом, грибы, являясь типичными эукариотическими
организмами, обладают в методическом отношении значительными
преимуществами перед высшими растениями. Они исключительно удобный объект
для изучения теоретических и прикладных проблем генетики.
В настоящее время генетические исследования проводят с представителями
разных классов грибов и вполне естественно, что каждый объект требует
определенного методического подхода. Ввиду большого разнообразия
морфологического строения грибов,способов их размножения и питания, часто
приходится модифицировать тот или иной метод применительно к каждому
объекту исследований или разрабатывать новые методики. Ниже изложены лишь
общие методические подходы к изучению генетики грибов. Более конкретные
сведения можно получить из журнальных статей и из, к сожалению,
немногочисленных специальных руководств [172, 406].
XIV.2. МЕТОДЫ МУТАЦИОННОГО АНАЛИЗА
Мутационный процесс может быть охарактеризован спектром мутантов и
частотой возникновения спонтанных и индуцированных мутаций. По
фенотипическому проявлению спектр мутантов условно подразделяют на
морфологический, биохимический и физиологический. Морфологические мутанты
различаются по размерам, форме, цвету и консистенции колоний, строению и
окраске мицелия и другим признакам. Биохимические, или ауксотрофные,
отличаются от исходных штаммов отсутствием способности синтезировать
определенные аминокислоты, витамины
345
или азотистые основания. Физиологические мутанты отличаются
чувствительностью к химическим и физическим факторам среды, способностью
поражать устойчивые к исходным штаммам сорта растений, активностью
ферментов.
Спонтанные мутации возникают редко, и выделение спонтанных мутантов -
процесс чрезвычайно длительный и трудоемкий. Для увеличения частоты
появления мутаций используют различные мутагенные факторы. В качестве
мутагенов наиболее часто применяют УФ-, рентгеновские и гамма-лучи и
химические вещества: азотистую кислоту, алки-лирующие соединения, аналоги
оснований и др. Механизмы мутагенного действия перечисленных факторов и
природа вызываемых ими первичных повреждений ДНК достаточно хорошо
изучены [173, 189, 416]. Рассмотрим наиболее важные приемы, которыми
необходимо овладеть при работе с мутагенами.
XIV.2.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ГРИБОВ
Обработке обычно подвергают многоклеточную суспензию конидий гриба в
дистиллированной воде или буфере. При наличии у грибов воздушного мицелия
необходимо отделить его от спор, что достигается фильтрацией. В
зависимости от размеров клеток можно пользоваться ватными, бумажными или
марлевыми фильтрами, центрифугированием и т. д. Суспензии дрожжевых и
дрожжеподобных грибов получают простым смывом клеток с поверхности
питательной среды. В камере Горяева подсчитывают число клеток в 1 мл и
при необходимости делают разведение суспензии до 106-109 клеток/мл.
XIY.2.2. ОБРАБОТКА МУТАГЕНОМ И ПОДБОР
ОПТИМАЛЬНЫХ ДОЗ ДЛЯ ИНДУКЦИИ МУТАНТОВ
Суспензию во время обработки мутагеном тщательно перемешивают магнитной
мешалкой или другими способами. При обработке УФ-луча-ми необходимо
соблюдать меры предосторожности во избежание фотореактивации. Для
получения кривых доза - эффект обычно используют не менее трех доз,
экспозиций или концентраций мутагена, дающих выживаемость 50, 10 и 1 %
соответственно. При этом за 100% принимают выживаемость клеток в
контроле, т. е. в необработанной мутагеном суспензии. Мутанты чаще всего
отбирают среди 1% выживших клеток. Однако максимальный выход мутантов
может наблюдаться в самом различном диапазоне доз, например при 30-50%-
ной выживаемости клеток. В связи с этим необходим предварительный подбор
оптимального уровня частоты мутаций.
Частота появления мутантов различна у разных видов и штаммов
грибов,зависит также от выбора мутации, по которой ведется учет,
мутагена, системы отбора мутантов и прочих причин. Поэтому, приступая к
серийным опытам, целесообразно провести предварительные эксперименты по
подбору оптимальных доз или концентраций мутагена применительно к
используемым штаммам гриба, питательным средам или сортам растений.
346
XIV.2.3. ПОСЕВ ОБРАБОТАННОЙ МУТАГЕНОМ СУСПЕНЗИИ
После обработки мутагеном суспензию высевают на питательную среду в таких
разведениях, чтобы число выросших колоний было по возможности одинаковым
независимо от увеличения дозы и не наблюдалось бы слияния колоний. При
работе с мицелиальными формами, колонии которых разрастаются по всей
