Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
изменяется в фиолетовый, а затем бурый.
Проба с ТХУ. Для анализа используют эфирные или спиртовоэфирные
экстракты. К 1-2 каплям экстракта, помещенным в фарфоровую чашечку,
прибавляют 5-8 капель 90%-ного раствора ТХУ и тщательно перемешивают. При
наличии фузариотоксинов экстракт
308
приобретает различные оттенки зеленого цвета, дендродохинов - синего,
стахиботриотоксинов - желтого и коричневого.
Химические методы определения токсичности не всегда совпадают с
биологическими и не являются строго специфическими.
Х.3.6. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ
В основе многочисленных методов обнаружения, идентификации и
количественного учета микотоксинов лежат хроматографические методы. С
помощью этих методов изучены многочисленные токсические метаболиты
грибов. Наибольшее распространение получил метод сборной бумажной и
тонкослойной хроматографии. В целом все известные методы, несмотря на их
различия, сводятся к нескольким общим приемам. Это прежде всего
экстрагирование микотоксина, собственно хроматографическое разделение
токсических веществ, хроматографическое разделение микотоксинов в
присутствии веществ а-свидетеля и определение количества вещества после
элюции с хроматограммы спектрофотометрическим методом.
Х.З.6.1. БИОАВТО ГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕНДРОДОХИНА
МЕТОДОМ СБОРНОЙ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Культуральную жидкость или концентрированные растворы неочищенной смеси
дендрохинов наносят на полоски хроматографической бумаги, один конец
которой закрепляют у пробки пробирок (3 X Х30,3 ХбОмм), а другой с
нанесенным токсином опускают в растворитель, не погружая линию старта. В
качестве растворителей используют эфир, петролейный эфир, хлороформ,
воду, кислоты, щелочи и т. д. (хроматография восходящая или восходяще-
нисходящая). После продвижения растворителя полоски бумаги вынимают,
просушивают, разрезают на части и проявляют биоавтографически: полоски
хроматограмм помещают на газон тест-культуры Candida stellatoidea 62 или
Saccharomyces vini "ф" на сусловом агаре в чашки Петри. Значение Rf
определяют по расположению зоны ингибиции роста тест-культуры.
Х.З.6.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ И ДРУГИХ МИКОТОКСИНОВ
МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Метод определения афлатоксинов основан на извлечении их из исследуемой
пробы органическими растворителями, очистке экстрактов и идентификации
афлатоксинов на тонкослойных хроматографических пластинках (ТСХ-
пластинки) по флюоресценции в ультрафиолетовом свете (УФ). Метод состоит
из двух этапов - качественного (экспрессного) и полуколичественного
определений [294].
Экспрессный вариант включает экстракцию афлатоксинов из пробы (50 г)
смесью воды с хлороформом, фильтрацию и обезвоживание экстракта, его
концентрацию, трехкратную очистку в тонком слое силикагеля диэтиловым
эфиром, разделение на той же пластинке в системе растворителей ацетон-
хлороформ (1 : 9) и идентификацию по флюоресценции в УФ-свете с длиной
волны 363-366 нм (Rf афлатоксина Вг - 0,45-0,5, афлатоксина В2 - 0,4-
0,45, свечение голубовато-синее). Продолжительность одного анализа
составляет 1-1,5 ч. Чувствительность определения - 0,3-1 мкг/пробу (16-20
мкг/кг).
309
Полуколичественное определение включает обезжиривание пробы (20 г)
петролейным эфиром или гек<2аном в аппарате Сокслета, экстракцию
афлатоксинов из обезжиренной пробы метанолом, переэкстрак-цию в
хлороформе, разделение экстракта на ТСХ-пластинках с силикагелем в
системе метанол-хлороформ (5 : 95) или ацетон-хлороформ (1 : 9) и
индентификацию по флюоресценции в УФ-свете (365 нм). Метод позволяет
установить минимальные количества афлатоксинов, дающие
на ТСХ-пластинке визуально отмечаемую флюоресценцию (0,4 нг афлатоксина
В^ и 0,3 нг афлатоксина Gx), и определить их концентрацию в пробе по
таблице или по формуле. Время одного анализа составляет 10- 12 ч.
Чувствительность определения -0,5 мкг/пробу (25 мкг/кг).
Иногда наряду с афлатокси-нами Bj; и В2 могут встречаться афлатоксины и
G2 с характерным желто-зеленым свечением в УФ-лучах (Rf - в пределах 0,3-
0,35), На практике эти фракции встречаются редко, причем обычно при
наличии афлатоксинов В. Определение концентрации афлатоксина в пробе при
наличии флюоресцирующих пятен проводят по табл. 24. После
хроматографирования ряда увеличивающихся по объему проб одного разведения
(например, 5, 10, 15 и 20 мкл раствора В) отмечают пробу с минимальным
объемом, в которой заметна флюоресценция, и рассчитывают концентрацию
афлатоксина В* в исследуемом продукте по формуле С = =400 JXIWV (мкг/кг),
где Д - объем, до которого доведен исходный экстракт (мл)} W - навеска
исследуемого продукта (г); V - минимальный объем пробы на пластинке,
дающий визуально отмечаемую флюоресценцию (мкл).
Пример. Из 20 г муки получено 100 мл экстракта, 25 мл которого развели до
100 мл. Из полученного раствора на хроматограмму нанесли 5, 10, 15, 20 и
25 мкм. Флюоресценция отмечена в пробах 25, 20 и 15 мкл, но отсутствует в
