Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
отсутствии токсина. Затем в каждую реакционную смесь последовательно
добавляют 0,1 Ки 14С-лейци-на, 2Ки 14С-урацила(21 мКи/ммоль) или 2Ки 14С-
тимидина (50мКи/ммоль), доводя объем раствора до 1 мл. Инкубируют еще 40
мин и добавляют равный объем холодной 10%-ной хлоруксусной кислоты.
Кислотонерастворимый осадок фракционируют для выделения белков,РНК и ДНК
(по принятым методикам). Определяют радиоактивность фракций [820].
Х.3.4.3. ИНГИБИЦИЯ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТКАХ ОПУХОЛИ
Клетки суспендируют в растворе Локка - Рингера, инкубируют в пробирках
Тунберга с токсином и без токсина при 37° С 40 мин. Содержание молочной
кислоты в реакционной смеси определяют по принятому методу [820].
Х.З.4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИЦИИ СИНТЕЗА БЕЛКА ТОКСИНАМИ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕТИКУЛОЦИТОВ КРОЛИКА
Кролику подкожно вводят 1,2%-ный раствор фенилгидразина из расчета 5 мг
на 1 кг живой массы ежедневно в течение 4 дней. На 7-й день берут кровь
из сердца, центрифугируют ее в течение 5 мин при 2000 об/мин. Осадок,
состоящий почти на 85% из ретикулоцитов, промывают двумя объемами
раствора Локка-Рингера на льду. Суспензию клеток сохраняют на холоду.
Для испытания действия токсина, в данном случае ниваленола, 0,1 мл
суспензии клеток ретикулоцитов, 0,3 мл раствора Локка-Рингера, 0,05 мл
раствора токсина инкубируют 15 мин при 37° С, затем вводят 0,05 мл (0,05
С) Ь-14С-лейцина в реакционную смесь и инкубируют еще 40 мин. Реакцию
останавливают добавлением 0,5 мл 10%-ной перхлорной кислоты, фильтруют
раствор через фильтровальную бумагу, промывают 5%-ной перхлорной кислотой
и смесью этанол- эфир (3 : 1 по объему). Определяют радиоактивность в
клетках. Точность метода, определяемая степенью ингибиции включения L-
14C-лейцина в белок, достигает 0,5 мкг. Метод может быть применен при
изучении цитологических изменений в клетке под влиянием токсинов.
Отмечено соответствие между токсичностью для мышей и уровнем ингибиции
включения Ь-14С-лейцина в белок [821].
Х.З.4.5. ДЕЙСТВИЕ АФЛАТОКСИНОВ НА МЕМБРАНЫ ЛИЗОСОМ
Нарушение синтеза ДНК и РНК, как следствие взаимодействия афлатоксина Вх
с молекулой ДНК, является наиболее рано выявляемым биохимическим эффектом
афлатоксинов, сопровождаемым сни-
307
жением активности РНК-полимеразы, общего и микросомального белка в печени
обезьян, угнетением синтеза липидов. Обнаружено прямое действие
афлатоксинов на структуру и функции митохондрий и рибо-сомальный аппарат
клетки, выявлено ингибирующее влияние на процессы гидроксилирования в
микросомах печени и снижение активности маркерного фермента микросом -
глюкозо-б-фосфатазы [363, 789]. Несмотря на многочисленные исследования,
биохимические механизмы действия большинства микотоксинов до настоящего
времени недостаточно выяснены. При интоксикации чувствительных к споро-
фузарину животных выявлена значительная избирательная инактивация
комплекса лизосомальных ферментов печени и повышение неседи-ментационной
активности кислых гидролаз, свидетельствующих о нарушении стабильности
мембран лизосом.
Спорофузарин оказывает резкое дестабилизирующее действие на мембраны
лизосом печени и селезенки крыс, не влияя существенно на стабильность
мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума, что находится в
соответствии с локализацией патологического процесса при отравлении
[434].
Х.3.5. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
МИКОТОКСИНОВ
Химические методы определения токсичности культур грибов весьма
разнообразны. Большинство методов разработано для культур грибов рода
фузариум и стахиботрис. Для анализа используют экстракты грибов.
Резорциновая проба. К определенному объему (1-5 мл) эфирного раствора
стахиботриотоксинов или фузариотоксинов добавляют 0,5-
2,5 мл концентрированной соляной кислоты и несколько кристалликов
резорцина. Соляная кислота в присутствии токсина окрашивается в
интенсивный красный цвет, через 24-48 ч выпадает осадок красного цвета.
Аналогичная реакция происходит с фецином, пироксиплекси-ном,
гидрохиноном.
Реакция с концентрированным раствором аммиака. К определенному объему (1
мл) раствора токсина в серном эфире добавляют 5-7 мл 96%-ного этанола,
осторожно подогревают и добавляют 5-7 мл 25%-ного водного раствора
аммиака. Кипятят 5-10 мин. Сначала появляется интенсивная черно-
фиолетовая окраска, затем выпадает осадок черного цвета.
Реакция с концентрированной соляной кислотой. Разработана для грибов рода
фузариум. К 1 м л экстракта приливают 0,5 мл концентрированной соляной
кислоты. При наличии токсических веществ раствор окрашивается в красный
или вишневый цвет.
Реакция Либермана - Бурхарда. Предложена для гриба стахиботрис и
некоторых компонентов спорофузарина. 2-3 мл экстракта выпаривают и вновь
растворяют осадок в хлороформе. К раствору добавляют несколько капель
уксусного ангидрида. На полученный раствор осторожно по стенке наслаивают
концентрированную серную кислоту. На границе раздела жидкостей, при
наличии токсических веществ, появляется кольцо зеленого цвета, который
