Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
сорочка с кровоизлияниями [243].
X.3.2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ
Метод используется главным образом для изучения цитологического и
биохимического действия токсинов.
Получение эмбриональных тканей. Для получения первичных культур обычно
используют 7-12-суточные эмбрионы цыплят и утят. Эмбрионы извлекают из
скорлупы в стерильных условиях, переносят в чашку Петри и удаляют глаза.
Промывают эмбрионы солевым раствором, измельчают на кусочки размером 1-2
мм, снова промывают и используют для выращивания фиксированных или
однослойных культур. Можно использовать отдельно органы или ткани
эмбриона для получения соответствующих культур. Эмбриональные ткани
млекопитающих получают от мышей, кроликов, крыс. Беременных животных
забивают, по возможности асептически извлекают эмбрион, отмывают от
крови, измельчают так же, как куриные эмбрионы.
Существует несколько методов культивирования клеток, органов, тканей.
Во флакон наливают несколько миллилитров плазмы крови кур, чтобы покрыть
дно, затем плазму отсасывают и петлей вносят 40-60 кусочков ткани,
равномерно распределяя их по дну. После свертывания плазмы во флакон
наливают питательную среду, закрывают пробками и помещают в термостат при
37° С. Среду меняют в зависимости от степени роста через 3-15 сут,
пересевают каждые 3-30 сут. При пересеве культуры извлекают из флакона в
чашку Петри и выре-
301
вают кусочки реэксплантации. Используют стационарный и погруженный методы
выращивания.
Получение однослойных первично трипсинизированных культур клеток.
Диспергируют кусочки ткани с помощью ферментов до получения суспензии
отдельных клеток, которые растут на внутренней поверхности сосуда
(пробирки, флакона). После промывания и измельчения ткани ее обрабатывают
трипсином, который разрушает вещества, связывающие клетки. В результате
получается взвесь отдельных клеток. Обычно для полной дезагрегации клеток
ткани применяют 0,25%-ный солевой раствор трипсина (чаще раствор Дифко)
или его смесь
Рис. 110. Распределение радиоактивности (3Н-уридина) в ядрах (?),
кариоплазме Щ1 и цитоплазме (В) клеток паренхимы и мезенхимы печени
куриного эмбриона 12-дневного возраста.
с панкреатином. Трипсинизацию проводят в колбах Эрленмейера g магнитной
мешалкой, которую специально монтируют в систему перемешивания и слива
клеточной взвеси. Трипсинизацию эмбриональных тканей проводят при 37° С в
течение 2-3 ч многократной сменой растворов трипсина до исчезновения из
среды взвешенных клеток. Жидкость со взвешенными клетками собирают, и
клетки осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7-10 мин,
затем ре-суспендируют в питательной среде (37° С) в определенном
количестве (подсчет производят в камере Горяева).
Получение культуры клеток печени куриного эмбриона. Из печени
свежедиссекцированных 12-дневных куриных эмбрионов готовят первичную
культуру. После трипсинизации культивируют клетки печени при 37° С в
бутылях на стекле.
1. К минимальной среде добавляют 5%-ный раствор коровьей сыворотки, 100
ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и вводят неочищенный
афлатоксин в концентрации 100, 50, 10, 1 мкг/мл. Клетки печени
анализируют через 1, 3, 6, 12 и 24 ч. Контроль - культура без афлатоксина
(или другого микотоксина). Клетки через указанные промежутки времени
фиксируют смесью - уксусная кислота - этанол - формалин, окрашивают
гематоксилином и районы ядер рассчитывают как круги или эллипсы. Измеряют
100 клеток паренхимы и 100 клеток мезенхимы. Ядра паренхимных клеток
чувствительны - они разрушаются, мезенхимных - устойчивы, не отличаются
от контроля.
2. Клетки обрабатывают афлатоксином в концентрации 10 или 0,3 мкг/мл в
течение 30 мин; 3; 24 ч. За 30 мин до конца каждого срока
802
клетки экспонируют в растворе меченого 8Н-уридина концентрацией 3 мкг/мл.
Через 3 ч экспозиции в ядрах и кариоплазме клеток паренхимы не
обнаруживаются зернышки серебра, а в клетках мезенхимы наблюдаются
незначительные изменения против контроля через 24 ч экспозиции.
3. После инкубации с неочищенным афлатоксином (1 мкг/мл) через 5; 15;
30 мин растущие клетки трижды промывают балансированным раствором Ганка и
затем 5 ч метят в растворе 3Н-уридина или 3Н-лей-цина концентрацией 3
мкг/мл. Наступает дегенерация ядер, вызванная ингибицией в них синтеза
РНК и затем белка (рис. 110).
Токсическое действие афлатоксинов на культуры клеток разных типов
проявляется в характерных патоморфологических изменениях клеток,
связанных с нарушением клеточного монослоя, изменением интенсивности
митотического деления и нарушением функциональной активности клеток.
Введение в культуру клеток 0,05 мкг/мл афлатоксина Вх полностью подавляет
рост клеток легкого эмбриона. ЛД50 для клеток Hela составляет 5-7 мкг/мл,
клеток печени взрослого человека - 14,3 мкг/мл. Токсическое действие на
клетки печени эмбриона человека оказывают также Gx, G2, В2 и другие
микотоксины.
X.3.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НА ЖИВОТНЫХ
