Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Приемы, с помощью которых извлекают активное начало, сводят к четырем
основным методам: 1) экстракции,
2) адсорбции, 3) элюции, 4) осаждению.
При извлечении антибиотиков из культуральной жидкости проверяют их
устойчивость к этой жидкости при разных значениях pH (3; 7; 10), при
комнатной температуре и нагревании до 60° С в течение 10 мин (для
выяснения белковой природы). Затем экстрагируют культуральную жидкость
различными органическими растворителями, подобранными методом сборной
хроматографии: хлороформом, бутано-лом, этилацетатом, эфиром и другими
при различных значениях pH. Если антибиотик переходит хотя бы в один из
растворителей, он в значительной степени освобождается от балластных
веществ. Если антибиотик не экстрагируется органическими растворителями
при разных значениях pH, испытывают его адсорбцию на угле с последующей
десорбцией водными растворами ацетона или адсорбцию на ионообменных
смолах. В некоторых случаях антибиотики выделяют путем осаждения из
культуральной жидкости, изменяя pH и добавляя соответствующие катионы или
анионы.
Антибиотики из мицелия грибов извлекают экстрагированием органическими
растворителями. Широкое распространение получил метод экстракции
измельченного мицелия (после отделения его от культуральной жидкости)
60%-ным спиртом-ректификатом в соотношении 1 : 5 (на 1 кг мицелия 5 л
спирта). Мицелий грибов заливают 60%-ным спиртом на сутки при температуре
37° С, затем спиртовой экстракт отфильтровывают, мицелий отжимают.
Фильтрат упаривают на водяной бане до 1/20 части первоначального объема.
В каждом отдельном случае получения антибиотических веществ из мицелия
грибов условия выделения выбирают экспериментально [455, 456]. Полученные
полуочищенные концентраты подвергают дальнейшей очистке и разделению
методом противоточной хроматографии (бумажной и тонкослойной) [66, 79].
Антибиотическую активность всех получаемых продуктов и фракций определяют
на всех этапах химической очистки антибиотиков микробиологическими
методами.
IX.7. ОТБОР ПРОТИВОВИРУСНЫХ АНТИБИОТИКОВ
Вирусы, являясь внутриклеточными паразитами, размножаются только внутри
живых клеток. Это обстоятельство определяет специфику оценки антивирусных
антибиотиков [146, 147, 480],
IX.7.1. МОДЕЛИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ
Для отбора противовирусных препаратов широко применяют модель вируса
гриппа при лабораторной вирусной инфекции. Белых мышей заражают через нос
суспензией легочной ткани мышей, содержащей 1-1000 инфекционных доз
вируса гриппа. Исследуемые культураль-
279
ные жидкости вводят подкожно 2 раза в день в максимальной дозе.
Продолжительность лечения, способы и пути заражения могут варьировать в
зависимости от конкретных условий опыта. С помощью этого метода выделен
противовирусный антибиотик геленин из Penicillium fimiculosum [119].
IX.7.2. КУЛЬТУРА ТКАНИ
Для культивирования вирусов используют ткани животных и человека. Метод
применяется для отбора антибиотиков, подавляющих вирусы с некротическим
действием. Пропитанные антибиотиком диски фильтровальной бумаги
раскладывают на поверхность агаризованной среды с культурой ткани. Если
изучаемый антибиотик задерживает рост вируса, вокруг диска видна зона
роста неповрежденных вирусом клеток ткани. С помощью этого метода были
изучены противовирусные свойства антибиотика М-8450 из Penicillium
stoloniferum [480].
IX.7.3. МОДЕЛИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВИРУСОВ
В качестве модели наиболее часто используют вирус табачной мозаики (ВТМ)
в разных модификациях.
Контактный тест. Антибиотик смешивают в равных объемах с суспензией
вируса. Смесь выдерживают 3 ч при 20° С. Затем ее втирают в листья табака
или дурмана. Учитывают число некротических пятен, вызванных вирусом в
контрольных и подопытных листьях.
Метод Шорина [480]. Из агаровой культуры гриба-антагониста вырезают блоки
и приклеивают их желатином к поверхности листа дурмана, зараженного
вирусом. Листья помещают во влажную камеру и через несколько дней
учитывают число некротических пятен. Если блок содержит антибиотик,
подавляющий развитие вируса, то вокруг блока ткань растения оказывается
здоровой.
Метод Рыжкова. Изолированные листья табака заражают ВТМ и погружают
половину листа в растворы, содержащие различные антибиотики. Контрольные
листья погружают в воду. Через 3-4 дня противовирусную активность
выражают соотношением числа некрозов на обеих частях листа.
Методы Шлигина, Роулинса, Егорова. Из листьев табака, зараженного ВТМ,
вырезают диски, которые помещают на поверхность раствора испытуемых
антибиотиков. Через определенное время определяют содержание вируса в
дисках.
IX.7.4. МОДЕЛИ ФАГОВ
Фаги обладают некоторыми признаками и свойствами, общими для вирусов
растений и животных, поэтому их можно использовать для первичного отбора
антибиотиков с антивирусным действием.
Контактный метод. Метод позволяет отобрать антибиотики с фа-Социдным
действием. Суспензию фага смешивают с изучаемым препаратом, выдерживают
