Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
культуры, измеряют диаметры зоны задержки роста тест-микроба. Расчет
количества антибиотика в 1 мл раствора ведут или по стандартной кривой,
полученной на полулогарифмической сетке, или по таблицам Дмитриевой [146,
147].
IX.4.2.2. МЕТОД ЛУНОК
В толще агаровой пластинки делают лунки диаметром 8 мм. В одни лунки
вносят раствор испытуемого антибиотика, а в другие - стандартный раствор
препарата и поступают так же, как и в методе цилиндров. Замена цилиндров
лунками дает преимущества при испытании трудно диффундируемых
антибиотиков.
Помимо методов, приведенных выше, известны экспресс-метод определения
антибиотической активности [119, 146, 147], различные химические и
физические методы определения активности пеницил-линов, цефалоспоринов,
гризеофульвина и других антибиотиков [136, 474].
IX.5. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ
Распознавание антибиотиков из грибов так же, как и антибиотиков,
образуемых другими микроорганизмами, на ранних этапах исследования
проводят несколькими способами: 1) ранней идентификацией антибиотика по
его продуценту и спектру антимикробного действия; 2) методом бумажной
хроматографии; 3) по устойчивым к определенным антибиотикам формам тест-
организмов; 4) характерным химическим реакциям и другим свойствам.
IX.5.1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПО ПРОДУЦЕНТУ
И СПЕКТРУ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ
Морфологические, культуральные, физиологические свойства, являющиеся
видовыми признаками гриба-антагониста, и спектр его антимикробного
действия по отношению к ряду тест-организмов позволяют высказать первые
предположения о том, продуцентом какого антибиотика является изучаемая
культура гриба. Естественно, что ранняя идентификация антибиотика
грибного происхождения по его продуценту имеет предположительный
характер. Известно немало случаев, когда один и тот же антибиотик
продуцировался разными видами грибов. Так, способность к биосинтезу
пенициллина выявлена у 26 видов рода Penicillium, 9 видов рода
Aspergillus, у возбудителя трихофитии - Trichophyton и у термофильного
гриба Malbranchea pul-chella. Синнематин (цефалоспорин), выделенный из
культуральной
275
жидкости Cephalosporium, идентичен пенициллину. Глиотоксин, например,
продуцируется триходермой, пенициллиями, аспергиллами; пеницилловая,
микофеноловая, пуберуловая, пуберулоновая кислоты, цитринин, патулин -
пенициллиями и аспергиллами. Поэтому при идентификации антибиотиков из
грибов кроме видового определения продуцента необходимо прибегать к более
точным методам распознавания антибиотических веществ, основанным на
сочетании биологических и химических исследований [47, 119, 136, 146,
457, 474].
IX.5.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ СБОРНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА БУМАГЕ
Для первичной характеристики исследуемых антибиотиков на ранних этапах
изучения (культуральная жидкость, экстракты из мицелия, агаровые блоки),
частичной идентификации, установления однородности и выяснения путей
дальнейшего препаративного выделения их используют метод сборной
хроматографии на бумаге, предложенный Ишида и дополненный рядом авторов
[66, 474].
На полосы хроматографической бумаги (ЛБ) шириной 1 см и длиной 20 см на
расстоянии 3 см от нижнего конца наносят микропипеткой 0,01 мл
культуральной жидкости, раствор антибиотика или блок, содержащий
продиффундировавший в толщу питательного агара антибиотик. Полосы
хроматографической бумаги с нанесенным на них антибиотиком помещают в
хроматографические камеры диаметром 5 см, высотой 40 см. На дно камер
наливают растворители (40 мл).
Восходящая хроматография. Набор систем растворителей может быть различным
и составлен по разным принципам. Для идентификации грибных антибиотиков
используют набор систем, предложенных чешскими исследователями [66]: 1)
дистиллированная вода; 2) 80%-ный ацетон; 3) я-бутанол, насыщенный водой;
4) этилацетат, насыщенный водой; 5) бензол, насыщенный водой; 6) ацетон -
бензол - вода (30 : 9 : 1); 7) изопропанол - хлороформ - бензол - вода
(30 : 4 :
: 4 : 2); 8) я-бутанол - гексан - ацетон - вода (20 : 9 : 10 : 10); 9)
метанол - изоамилацетат - вода (25 : 14 : 1).
Растворители наливают в камеры заранее для насыщения их объема. После
прохождения растворителем отмеченного расстояния (20 см) хроматограммы
извлекают из камер, высушивают на воздухе и проявляют биоавтографически
на агаризованных средах, засеянных чувствительной к изучаемому
антибиотику культурой тест-микроорганизма. Антибиотические вещества
проявляются на однородном микробном газоне в кюветах в виде зон угнетения
роста тест-микроба после его 24-часовой инкубации при оптимальной
температуре (рис. 107). Измеряют расстояние от точки нанесения
антибиотика до середины стерильной зоны, образующейся вокруг участков
хроматограммы, и вычисляют значение Rf антибиотика [66]. На основании
значений Rf строят кривые зависимости растворимости данного
антибиотического вещества от применяемых систем растворителей. На оси
абсцисс откладывают обозначения растворителей, на оси ординат - значения
