Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
выросшей на агаризованной среде Чапека; 3 - матрац с культурой гриба,
выращенной методом поверхностного культивирования; 4 - колба с культурой
гриба, выращенной методом погруженного культивирования; 5 - агаризованная
среда Ридера, используемая при качественном определении витаминов группы
В; 5.1 - кювета с разлитой агаризованной средой Ридера и нанесенным на ее
поверхность блоком из мицелия (а), контролем витамина (б), фильтром,
смоченным культуральной жидкостью (в); 5.2 - блоки с мицелием и зоны
роста индикаторной культуры вокруг них.
263
груженном - 2-4 сут), на поверхность агаризованной среды Ридера наносят
кружки фильтровальной бумаги, смоченной культуральной жидкостью гриба,
или культуральную жидкость вводят в цилиндрики. Контролем служит
определяемый витамин. Кюветы со средой выдерживают в термостате при
температуре 28° С. По истечении 2 сут учитывают размеры зон роста
индикаторной культуры вокруг мице-лиального блока, фильтра, цилиндрика
(рис. 102).
VIII.2.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Микробиологический метод определения витаминов дает возможность уловить
ничтожно малые количества витамина (микрограммы) в среде. При определении
витаминов по степени роста индикаторной культуры их количество выражают
через массу клеток (в миллиграммах). Для этого грибы выращивают на
синтетических питательных средах. В опыте для роста индикаторной культуры
на определяемый витамин используют жидкую питательную среду Ридера.
Содержание витаминов определяют в культуральной жидкости (0,1-0,2 мл) и
гидролизатах мицелия (0,1-0,2 мл).
Большая часть витаминов группы В находится в клетке гриба в связанной
форме. Для перевода витамина в свободное состояние используют автолиз или
кислотный гидролиз (предпочтительно) [303].
Навеску сухого мицелия (20-50 мг) тщательно растирают и помещают в
градуированные пробирки емкостью 10 мл. Навеску и разведение экстракта из
мицелия подбирают для исследуемого штамма гриба экспериментально в
зависимости от содержания в мицелии того или иного витамина. Мицелий
заливают определенным объемом серной кислоты в концентрациях, необходимых
для экстракции витаминов (0,1 н.- для тиамина; 1,0 н.- для пиридоксина и
никотиновой кислоты; 6 н - для биотина), и подвергают гидролизу в
автоклаве под давлением в 1 атм либо при определении тиамина кипятят на
водяной бане в течение 45 мин. Для освобождения пантотеновой кислоты из
ее связанных форм проводят гидролиз мицелия протеазой (выделенной,
например, из Aspergillus terricola и приготовленной на фосфатном буфере
(pH 7,0), в течение 18 ч при температуре 28° С [209]. Раствор фермента
готовят из расчета 5 мг фермента на 1 мл фосфатного буфера. Для навески
сухого мицелия в 25 мг используют 1 мл раствора фермента. Полученные из
мицелия гидролизаты, кроме гидролизата для определения пантотеновой
кислоты, нейтрализуют соответственно 0,1; 1,0; 6,0 н. NaOH до pH 7,0.
Общий объем доводят дистиллированной водой до 5-10 мл в зависимости от
концентрации витамина в гидролизате. Затем фильтруют и стерилизуют
кипячением (20 мин) на водяной бане (см. рис. 102).
Длительность сохранения разных витаминов в гидролизатах и культуральной
жидкости не одинакова. Наиболее лабильна пантоте-новая кислота, которая в
течение месяца разрушается более чем на
П
от
Рис. 103. Зависимость роста индикаторной культуры от концентрации тиамина
в среде (D - оптическая плотность; С - концентрация тиамина, мкг/мл).
264
50%. Несколько медленнее снижается содержание тиамина, пиридоксина,
никотиновой кислоты, которые сохраняются в течение нескольких недель без
разрушения. Наиболее устойчив биотин, содержание которого в гидролизатах
не изменяется в течение нескольких месяцев.
Среду Ридера с индикаторной культурой и витаминами разливают по 5 мл в
пробирки и вносят 0,1-0,2 мл гидролизата мицелия или культуральной
жидкости. Пробирки с пробой фиксируют в наклонном положении (для лучшей
аэрации), инкубируют при 28° С в течение 48 ч. После инкубации в каждую
пробирку добавляют по 2 капли концентрированной серной кислоты для
приостановления роста дрожжевой культуры. Содержание выросших дрожжевых
клеток в среде определяют по оптической плотности среды на ФЭК-56 (460
нм) с зеленым светофильтром. В качестве контроля используют среду Ридера
с индикаторной культурой.
Одновременно испытывают влияние на рост индикаторной культуры различных
концентраций определяемых витаминов и на основании полученных данных
строят стандартную кривую, показывающую зависимость роста дрожжевых
клеток, определяемого по оптической плотности, от содержания
кристаллического витамина в среде (рис. 103). Основной раствор содержит
500 мкг/мл изучаемого витамина. Для его приготовления 5 мг витамина
растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды, кипятят 10-15 мин и
хранят в холодильнике в течение месяца.
Стандартные растворы содержат (мкг/мл): 0,002-1,0 тиамина; 0,0004-0,1
биотина; 0,02-25,0 никотиновой кислоты; 0,05-10,0 пантотеновой кислоты;
