Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
VI.1.2.6. ТЕХНИКА ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
Для одномерных хроматограмм используют листы бумаги, нарезанные поперек
волокон. 40-50 мкл исследуемой смеси, содержащей 60-70 мкг аминокислот,
накосят микропипеткой на лист каждые 2,5-3 см, отступая от верхнего края
5-6 см. Бумагу помещают в хроматографические камеры и пропускают
растворитель. Одновременно с исследуемой смесью разделению подвергается
раствор смеси известных аминокислот.
При хроматографическом разделении веществ необходимо поддерживать строго
определенную температуру (обычно 20-22 ± 2°С). Для этой цели в
лабораториях обычно служат термостатированные хроматографические комнаты.
При колебаниях температуры во время хроматографирования четкость
проявления веществ на хроматограммах ухудшается. Подавляющее большинство
растворителей удаляют из бумаги высушиванием в токе воздуха при комнатной
температуре или при температуре 40-60° С в специальных сушильных шкафах.
После удаления растворителя ее обрабатывают реактивами, дающими цветные
реакции с изучаемыми аминокислотами. При этом пользуются пульверизатором
либо быстро погружают бумагу в соответствующий раствор на 3-5 с. Для
обнаружения аминокислот используют растворы нингидрина и изатина. После
хроматографирования и проявления хроматограммы визуально сопоставляют
цвет и положение пятен известных и определяемых аминокислот.
230
VI.1.2.7. ПРОЯВИТЕЛИ
Присутствие в исследуемой смеси некоторых аминокислот выявляют с помощью
проявителей (раствор изатина). При этом каждая аминокислота окрашивается
различно. Так, изатин позволяет обнаружить весьма незначительные
количества пролина. Вследствие того что каждая аминокислота при действии
изатина приобретает специфический цвет или оттенок, удается
идентифицировать аминокислоты с весьма близкими значениями Rf, что
является существенным преимуществом метода.
Для идентификации глицина и аспарагиновой кислоты, имеющих близкие
значения Rf, используют метод окраски нингидрином в сочетании с изатином
[520]. При этом на месте расположения аспарагиновой кислоты, примерно
через сутки, образуется зеленоватое пятно, на месте расположения глицина
- белое на темном фоне. Раствор изатина готовят на 96%-ном этаноле,
содержащем 1 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл спирта. Концентрация
изатина - 1%. [76]. Чувствительность этого метода, однако, ниже, чем при
использовании нингидрина. Многие аминокислоты обладают одинаковой
чувствительностью к нингидрину, так что можно пользоваться одним
калибровочным графиком при количественном определении группы аминокислот
[344]. При реакции аминокислот с нингидрином (трикетогидринденом) сначала
в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином возникает Шиффово
основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и
расщепляется на альдегид и аминодике-тогидринден, который конденсируется
с аде одной молекулой нингидрина, и образовавшееся соединение,
енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название "сине-
фиолетовый Руэмана" по имени исследователя, впервые (в 1910 г.)
изучившего эту реакцию. Реакция протекает в присутствии органических
растворителей (ацетона, эталона, пиридина и др.), на основе которых
готовят раствор нингидрина. Продукт реакции содержит радикал (R) исходной
аминокислоты, который обусловливает различную окраску (голубую, красную и
т. п.) соединений аминокислот с нингидрином [446].
Существует несколько вариантов применения растворов нингидрина.
Большинство из них содержит стабилизирующее окраску вещество. В качестве
стабилизаторов применяют соли, содержащие ионы кобальта, меди, никеля,
кадмия. Установлено, что продукт взаимодействия аминокислоты с
нингидрином реагирует с ионами металлов, образуя устойчивое красно-
оранжевое соединение [646].
При качественном определении аминокислот хроматограммы проявляют 0,2 -
0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне или бутиловом спирте с
дальнейшей экспозицией в течение 24 ч в темноте (или хроматограммы
помещают на 5-10 мин в термостат при температуре 80-90° С), а затем
фиксируют спиртовым раствором азотнокислой меди (к 1 мл насыщенного
раствора Cu(N03)2 добавляют 0,2 мл 10%-ного раствора HN03 и доводят до
100 мл 95%-ным этиловым спиртом).
Для количественного определения аминокислот используют нингид-риновый
проявитель следующего состава: 95 частей 0,5%-ного раствора нингидрина в
ацетоне смешивают с 1 частью ледяной уксусной кислоты и 4 частями воды
[439]. Хроматограммы высушивают на воздухе, а затем помещают для полного
проявления в темноту на 24 ч (преимуществом такого проявления является
чистый фон хроматограмм). Пятна, проявленные раствором нингидрина,
элюируют метиловым
231
спиртом, 50%-ным этанолом, содержащим 0,025 М фосфатный буфер (pH 7,0)
[745], 60%-ным этанолом, 75%-ным этанолом, содержащим CuS04.
VI.1.3. ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Перед нанесением на бумагу исследуемый материал должен быть
