Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 108

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 279 >> Следующая

активности. Реакционная система для спектрофотометрического определения
сукцинатдегидрогеназы включает (мкмоль): 3 феррицианида калия,
растворенного в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2; 30 цианида калия; 40
янтарной кислоты; 0,2 мл ферментного препарата. Оптическую плотность
измеряют при 400 нм как функцию времени [270, 519].
223
Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37) осуществляет окисление яб-лочной
кислоты в ЩУК в НАД^-зависимом процессе. В основе метода определения
активности фермента лежит изменение оптической плотности при окислении
кофермента в обратимой реакции. Реакционная система включает (мкмоль):
200 Трис-буфера, pH 7,3; 15 MgCl2; 0,5 НАД"*"; 3 ЩУК; 0,2 мл ферментного
препарата. Изменение оптической плотности учитывают при 340 нм [270,
601].
Ферменты глиоксилатного цикла. Ключевыми ферментами этого цикла являются
изоцитрат-лиаза и малат-синтаза. Ниже приведено описание методов
определения активности этих ферментов.
Изоцитрат-лиаза (К.Ф.4.1.3.1) катализирует расщепление изолимонной
кислоты в янтарную и глиоксиловую. В основе метода лежит способность
глиоксиловой кислоты реагировать с фенилгидразинами. Образующийся
фенилгидразон глиоксиловой кислоты при спектро-фотометрии дает
характерное поглощение при 324 нм (молярный коэффициент экстинкции -
17,0). Реакционная смесь включает (мкмоль): 75 фосфатного буфера, pH
6,85; 8 фенилгидразина-НС1; 4 цистеина-НС1; 10 MgCl2; 4 изолимонной
кислоты; 0,2 мл ферментного препарата [270, 564, 722].
Малат-синтаза (К.Ф.4.1.3.2) осуществляет конденсацию глиоксиловой кислоты
с ацетил-КоА с образованием яблочной кислоты и КоА. В основе метода лежит
тот же принцип, что и при определении цитрат-синтазы. Реакционная смесь
состоит из (мкмоль): 100 Трис-буфера, pH 8,3; 0,25 ацетил-КоА; 10 MgCl2;
0,33 реактива Эллмана; 5 глиоксиловой кислоты; 0,2 мл ферментного
препарата. Оптическую плотность измеряют при 412 нм (молярный коэффициент
экстинкции образующегося меркаптида-КоА 13,6) [270, 564, 722].
VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКА У ГРИБОВ
Белки являются одним из главных компонентов структурных элементов клетки
и принимают активное участие в процессах метаболизма. В организме грибов
они выполняют самые разнообразные функции: защитную, каталитическую,
регуляторную, транспортную, трофическую и др. Молекулы белка построены из
аминокислот. В настоящее время описано около 200 аминокислот; из них лишь
22 входят в состав белков.
Большинство физиологических процессов связано с обменом аминокислот,
осуществляемым с помощью чрезвычайно лабильных и многообразных реакций.
Аминокислоты поставляют материал не только для синтеза белков, НК,
витаминов, но и антибиотиков, алкалоидов, пигментов, токсинов и др.
Методы определения белков и аминокислот у микроскопических грибов очень
трудоемки; их описание до сих пор не было обобщено в специальном издании.
Ниже приведено описание некоторых из них.
VI.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ
VI.1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Изучение аминокислот с помощью хроматографии, колориметрии,
электрофореза, методов, основанных на использовании мутантов с разной
потребностью в отдельных аминокислотах, и других позволило выяснить
некоторые особенности обмена грибов, имеющие общебиологическое значение.
Хроматографические методы подразделяют на адсорбционные, ионообменные,
осадочные, распределительные. Широкое распространение получила
хроматография с наложением электрического поля. Метод распределительной
хроматографии па бумаге - один из наиболее быстрых, точных и простых
методов анализа сложных смесей веществ (химические методы определения
ряда аминокислот очень трудоемки, недостаточно чувствительны и
специфичны) (табл. 14).
В настоящее время всеобщее признание получил метод количественного
определения аминокислот с помощью автоматических анализаторов [12, 44,
142]. Перед анализом исследуемое вещество освобождают от аммиака и
растворяют в б\фсрном растворе (0,2 н. Г\аС1 и 0,01 н. НС1) или 10% -пом
растворе изопропилового спирта. Количество
8 2-63
225
Ti блина 14. Сравнение различных методов определения аминокислот [390J
Метод анализа
Преимущества
Недостатки
Выделение отдельных аминокислот Колориметрия
Химические методы ре-
Воспроизводимость
зультатов
Может использоваться в отдельных случаях для определения, например,
цистеина, триптофана, тирозина в ин-тактных белках
Большое количество исходного материала
Недостаточная чувствительность и специфичность
Физико-химические методы
Масс-спектрометрия
Хроматография на бумаге
Ионообменная
хроматогра-
фия
Высокая точность
Высокая чувствительность, быстрота получения ответа
Высокая точность, специфичность, скорость, воспроизводимость результатов
при малых количествах материала. Метод удобен для полного анализа
аминокислот в образцах неизвестной природы
Сложное, дорогостоящее оборудование и аминокислоты, содержащие тяжелый
изотоп азота ("N)
Ограниченная точность и специфичность. Трудность обнаружения ничтожных
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed