Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
подвергавшийся действию фермента. Затем к растворам прибавляют 2,5 мл
формольной смеси и титруют 0,2 н. раствором NaOH до ярко-красной окраски.
Из количества щелочи, затраченной на титрование опытной пробы, вычитают
количество щелочи, затраченной на титрование контроля.
Расчет: 1 мл 0,2 н. раствора NaOH, использованного на титрование,
соответствует 2,8 мг N. Содержание аминного азота в растворе определяют,
умножая количество затраченного на титрование 0,2 н. раствора NaOH (в
миллилитрах) на 2,8.
V.9.5. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ
ПО ПРИРОСТУ АМИННОГО АЗОТА [32, 371]
Метод основан на йодометрическом определении способности аминокислот и
различных пептидов образовывать комплексные растворимые соединения с
медью.
К определенному количеству испытуемого раствора (например, ферментного
гидролизата), содержащего смесь аминокислот и пептидов (при слабощелочной
реакции), прибавляют в избытке суспензию фосфата меди в боратном буфере.
В результате после взбалтывания медные соли большинства аминокислот
переходят в раствор. Избыток фосфата меди отфильтровывают, в прозрачный
раствор добавляют уксусную кислоту и определяют медь йодометрическим
способом.
Реактивы: 1) раствор хлорной меди (27,3 г на 1 л Н20); 2) трехза-мещенный
фосфат натрия (64,5 г Na2HP04 растворяют в 50 мл дистил-
210
лированной воды без С02, добавляют 7,2 н. NaOH; после растворения доводят
объем раствора до 1 л водой); 3) боратный буфер (5,7 г буры Na2B407-
натрий тетраборнокислый) растворяют в 150 мл воды, прибавляют 10 мл 1 н.
раствора НС1 и доводят объем раствора до 200 мл;
4) суспензия фосфорнокислой меди (один объем реактива 1 добавляют к
двум объемам реактива 2, перемешивают и приливают два объема реактива 3);
5) раствор 0,25 г тимолфталеина в 100 мл 50%-ного этилового спирта; 6)
80%-ная уксусная кислота; 7) свежеприготовленный раствор 0,01 н. раствора
гипосульфита натрия (Na2S203); 8) 0,5 н. раствор NaOH.
Последовательность определения. 1-2 мл ферментного гидролизата помещают в
колбу емкостью 25 мл, нейтрализуют 0,5 н. раствором NaOH по тимолфталеину
до слабо-голубого окрашивания. В колбу добавляют 10-12 мл смеси,
состоящей из взвешенного осадка фосфата меди (реактив 4), объем раствора
доводят водой до метки, встряхивают и центрифугируют или фильтруют через
плотный фильтр. 10- 15 мл отфильтрованного раствора переносят в колбу,
подкисляют 0,25- 0,5 мл 80%-ной уксусной кислоты, добавляют 0,2-0,4 г КС1
и титруют выделившийся йод 0,01 н. раствором Na2S203, добавляя к концу
титрования 2-4 капли раствора 0,1%-ного крахмала до исчезновения синей
окраски.
Расчет: количество 0,01 н. раствора Na2S203, использованного на
титрование, умножают на 0,28. Результат соответствует содержанию аминного
азота во взятой пробе (в миллиграммах).
V.9.6. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ
[275, 334, 375, 380]
Метод основан на способности белковых субстратов и продуктов их
ферментативного расщепления поглощать свет в ультрафиолетовой части
спектра. Поглощение света обусловлено наличием ароматических аминокислот,
в основном тирозина и в меньшей степени триптофана, причем максимум
поглощения наблюдается при длине волны 275-280 нм. В качестве субстрата
для действия ферментов обычно используют казеин или гемоглобин.
Приготовление гемоглобина. В сосуд с бычьей кровью прибавляют раствор
цитрата натрия (3 г на 1 л крови) для предотвращения ее свертывания.
Кровь перемешивают и центрифугируют. Плазму крови и белые кровяные
тельца, которые образуют тонкий слой на поверхности, удаляют
сифонированием. Эритроциты смешивают с равным объемом охлажденного 1%-
ного раствора NaCl и вновь центрифугируют. Над-осадочную жидкость
удаляют, а осадок взбалтывают и диализируют в целлофановых мешочках
против дистиллированной воды на холоду. После 24-часового диализа
содержимое всех мешочков смешивают и хранят гемоглобин в замороженном
состоянии. Для определения обычно берут 2,5%-ный раствор гемоглобина.
Приготовление раствора казеина. Навеску казеина по Гаммарсте-ну
суспендируют в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере (pH 8) и выдерживают на
водяной бане при температуре 60-70° С 40 мин (до полного растворения
казеина). Затем 0,05 М раствором лимонной кислоты доводят pH растворов до
нужного уровня. Раствор казеина можно хранить на холоду в течение недели.
Для определения используют обычно 1%-ный раствор казеина.
211
Последовательность определения. В пробирки вливают по 1 мл цитрат-
фосфатного буфера, 1 мл исследуемой культуральной жидкости или раствора
фермента и помещают их в термостат при определенной температуре на 5-10
мин для нагревания до данной температуры. Затем в смесь прибавляют 1 мл
субстрата (гемоглобина или казеина), перемешивают и инкубируют. Реакцию
останавливают прибавлением равного объема ТХУ. Контрольный опыт готовят
так же, только перед внесением раствора субстрата к реакционной смеси
прибавляют 10%-ный раствор ТХУ. Растворы фильтруют, и на спектрофотометре
