Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
335
бенно близки инсулины человека и свиньи: у последнего лишь С-концевой
треонин В-цепи заменен на аланин. Инсулины коровы и человека различаются
по трем аминокислотным остаткам, и именно этими различиями определяется
повышенная •иммуногенная активность инсулина коровы по сравнению с
инсулином свиньи. Почти у всех больных, которых лечат обычным методом, т.
е. вводят им инсулин коровы, в крови появляются антитела к инсулину.
Антигенные свойства инсулина частично определяются и примесями в его
препаратах. Скорее всего именно образованием антител к инсулину
объясняются некоторые незначительные побочные эффекты при инъекциях
инсулина коровы, например атрофия подкожной жировой прослойки в месте
повторного введения. В случае высокоочищенного инсулина свиньи эти
эффекты отсутствуют. Далее, антитела к инсулину инактивируют его в
кровотоке, так что больному приходится вводить большие дозы, чем это
необходимо. Антитела, вероятно, влияют и на продолжительность
биологического действия введенного инсулина. Надежных данных о том, что
антитела способны вызвать более долгосрочные и серьезные нарушения, нет.
Можно думать, что инсулин человека будет еще менее иммуногенным, чем
инсулин свиньи (это естественно, поскольку он не является чужеродным
белком).
Так как число больных диабетом и соответственно потребность в инсулине
растут, то вполне возможно, что Доступность его в будущем уменьшится из-
за нехватки исходного сырья - поджелудочной железы животных. Столь же
очевидно, что из-за чисто эмоциональных факторов лучше использовать
инсулин человека, чем каких-либо животных.
Ряд производителей инсулина во главе с фирмой Eli Lilly and Со.
использовали как основу для производства инсулина человека технологию
рекомбинатных ДНК. Согласно схеме процесса, разработанного Eli Lilly в
сотрудничестве с фирмой Genenetech Inc. (рис. 8.3), на первом этапе
воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности
инсулина, раздельно синтезируя искусственные гены его А- и В-це-пей. На
5'-конце каждого из них располагается кодон метионина (который в
синтезированном белке оказывается N-концевым), а на З'-конце-
терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивают затем в ген
р-галактозидазы плазмид, а их в свою очередь вводят в клетки Е. coli.
Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, а не с глюкозой, то в
них индуцируется синтез р-галактозидазы, а вместе с ней - А- и В-цепей
инсулина, присоединенных через остаток метионина. После лизиса бактерий и
обработки бромцианом, который специфически расщепляет белки по остатку
метионина, цепи инсулина отделяют от р-галактозидазы (инсулин метионина
не
336
Глава 8
Синтез гена А-цепи Встраивание в плазмиду
Синтез гена В-цепи Встраивание в плазмиду
Введение в Е. co/i
Введение в Е. coll
Ген В-цепи
Плазмида
В-цель
0-Gal
Лизис клеток ч/
Расщепление бромцианом ^ Очистка
Инсулин
Рис. 8.3. Получение инсулина человека на основе технологии рекомбинантных
ДНК (Miller, Baxter, 1980).
содержит). Затем проводят очистку цепей и их объединение (с низким
выходом), в результате чего образуется нативный двухцепочечный инсулин.
Было показано, что он не содержит белков Е. coli, эндотоксинов и
пирогенных веществ, по физическим свойствам неотличим от инсулина из
поджелудочной железы человека и в тест-системе (гипогликемия у животных)
проявляет полную биологическую активность.
Медицина и биотехнология
337
Инъекция Инъекция
Рис. 8.4. Изменение содержания глюкозы в плазме здоровых добровольцев под
действием малых и больших доз инсулина человека, полученного на основе
технологии рекомбинантных ДНК, и инсулина из поджелудочной железы свиньи
(Keen et al., 1980). Вверху - биологический ответ при подкожном введении,
внизу - при внутривенном введении в течение 1 ч.
Впоследствии был испытан альтернативный метод: синтезировали ген
молекулы-предшественника, проинсулина, который и вводили в Е. coli. После
очистки проинсулина его расщепляли трипсином и p-карбоксипептидазой и
получали нативный инсулин.
Инсулин человека, полученный с помощью Е. coli, оказался первым "генно-
инженерным" белком, испытанным на людях. В опытах со здоровыми
добровольцами было установлено, что он безопасен, во всяком случае при
краткосрочном применении (не вызывает аллергических и иных нежелательных
реакций) и обладает практически одинаковой с инсулином свиньи
способностью снижать уровень глюкозы в крови при введении его под кожу
или внутривенно (рис. 8.4). В настоящее время такой
22-1344
.338
Глава 8
инсулин человека получают множество диабетиков во всем ми-;ре. Этому
предшествовали клинические испытания, в ходе которых изучались изменения
метаболизма и иммунологические эффекты. Сегодня это уже обычный метод
лечения.
Интерферон
Интерфероны - это группа белков, открытых в ходе изучения веществ,
вырабатываемых клетками, зараженными вирусами. •Они индуцируют как
локальные, так и системные противовирусные реакции в других клетках.
