Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
вначале выделяют- соответствующую мРНК. Как правило, осуществить прямую
экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку
эти гены содержат интроны. Интроны - это декодирующие участки гена; вся
информация об аминокислотной последовательности белка содержится, в
других участках ^ экзонах. Зрелые молекулы мРНК клеток млекопитающих не
содержат последовательностей, комплементарных интронам: они удаляются
ферментами в процессе, называемом сплайсингом. Следовательно, такие
молекулы можно транскрибировать с помощью ферментов ревертазы (обратной
транскриптазы) и ДНК-полимеразы с образованием ДНК.^Некоторые гены
животных, например кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат
нитронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных или дрожжевых
клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать мРНК,
то прежде всего следует найти ее источник - ткань, в которой этот продукт
образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат
опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую мРНК.
После транскрипции данной мРНК ,и получения комплементарной ДНК (кДНК) '
необходимо определить, какие из множества молекул этой кДНК содержат ген,
подлежащий выделению и экспрессии. На этом этапе работы молекулы кДНК
обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат
векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами кДНК.
переносят в клетки подходящих бактерий-хозяев.
316
Глава 7
Идентификация искомых клонов занимает иногда много" времени. Если же
клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК
относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом
случае колони" бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают
на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательной
среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК
денатурируют. При этом она! остается связанной с фильтром. Далее на
фильтр наносят радиоактивный зонд - денатурированную ДНК или РНК, которая
связывается с гомологичной или частично гомологично" бактериальной ДНК.
Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с
гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии,
связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых
наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из
дубликата - реплики набора колоний.
Если специфический зонд отсутствует, то его можно синтезировать
химическими методами, если известна полностью ил" частично аминокислотная
последовательность белка - продукта интересующего нас гена. Конечно,
определить точную нуклеотидную последовательность, исходя из
аминокислотной последовательности, нельзя, поскольку каждая аминокислота
может кодироваться разными триплетами (от 1 до 4). Однако, зная
аминокислотную последовательность, можно синтезировать набор зондов и
идентифицировать с их помощью плазмиды с частично гомологичными
последовательностями.
Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии
включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для
чего используются иммунологические методы или методы определения его
специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем
скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто
используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого
пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и
помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-
ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов,
адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии.
Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы
Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется
для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli,
плазмидный вектор скорее все-
Генетика и биотехнология
317
го представляет собой производное pBR322, а если хозяином является
Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus
или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae конструируют либо
на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы
дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко
используются челночные векторы, которые мо-
• ¦ .CCTAGG.
GGATCC________
• • • .AGCT. ..
I
Г
3VJ • • • •
Т
гут реплицироваться в одном РисЛА Нуклеотидные последователь-ИЛИ
неСКОЛЬКИХ организмах- ности, узнаваемые и расщепляемые эн-
хозяевах. Применение таких донуклеазами рестрикции Alul (ввер-векторов
оказывается весьма ху) и BamHl (внизу). перспективным в связи с тем,
что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации
ДНК удобнее в роли хозяина использовать Е. coli. Строение плазмиды pBR322
показано на рис. 7.3. Она несет гены устойчивости к тетрациклину и
