Биотехнология. принципы и применение - Бич Г.
ISBN 5-03-000058-5
Скачать (прямая ссылка):
Agrobacterium. Мол. масса плазмид грамположитель-яых бактерий лишь в
отдельных случаях превышает 40-106.
В. бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых
двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находятся в сверхспиральном
состоянии. Некоторые из плазмид могут существовать лишь в клетках одного
или двух близких видов. К числу плазмид с широким кругом хозяев относятся
RP4, R68.45, RK2 и сходные с ними плазмиды, несущие маркер устойчивости к
лекарственным препаратам (R-плазмиды), которые принадлежат P-группе
несовместимости (члены одной и той же группы несовместимости не могут
сосуществовать в бактериальной клетке). Эти плазмиды были перенесены во
многие виды грамотрицательных бактерий; создается впечатление, что их
хозяевами могут быть все штаммы грамотрицательных бактерий.
Таким образом, R-плазмиды, относящиеся к группе Р, особенно подходят для
генетических экспериментов с грамотрица-
304
Глава 7
тельными бактериями, используемыми в промышленности. При помощи этих
плазмид мы можем осуществлять перенос хромосомных генов между
неродственными видами. Небольшие по размеру производные плазмид RP4 и RK2
используются как векторы для клонирования молекул ДНК, которая затем
может быть перенесена в клетки самых разных видов.
Рис. 7.3. Плазмиду pBR322 получают путем объединения плазмид ТпЗ, pSClOl
и pMBl. [J. G. Sutcliffe (1979) Cold Spring Harbor Simposia on
Quantitative Biology, 43, 77-90.] Плазмида pMBl сходна с плазмидой ColEl.
Устойчивость к ампициллину определяется геном [5-лактамазы. Указано
направление транскрипции этого гена. Стрелками отмечены уникальные сайты
расщепления pBR322 некоторыми ферментами.
Репликация некоторых типов плазмид тщательно изучена, и нам известны
сегодня многие детали этого процесса, особенно для небольшой плазмиды
ColEl. Эта информация помогает при использовании плазмид для клонирования
генов. Чаще всего применяют производные плазмиды pBR322 длиной 4362 пар
нуклеотидов, несущей гены устойчивости к пенициллину и тетрациклину. Эти
гены были перенесены из R-плазмид (рис. 7.3)
Генетика и биотехнология
30S
в фрагмент небольшой плазмиды pMBl, которая близка кочень хорошо
изученной небольшой плазмиде ColEl.
Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. со-U и близких видах
Enterobacteriaceae. В бактериальных клетках они представлены несколькими
копиями; так,для ColEl число плазмидных копий на хромосому равно примерно
20, а для pBR322 - 40. Это обстоятельство очень важно для клонирования.
Чем больше число копий клонированного гена, тем выше; выход кодируемого
белка. Кроме того, многокопийные плазмиды не так легко утрачиваются при
культивировании. С другой; стороны, малое число копий плазмиды иногда
имеет свои преимущества, например при клонировании таких генов, продукты
которых гибельны для бактериальной клетки в большом количестве.
Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных
плазмид посвящено множество работ. Было обнаружено, что число копий
плазмид примерно одинаково в-клетках, размножающихся с разной скоростью.
Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом
бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов,
контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она
идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения
бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в
случае много-копийных плазмид, чем малокопийных.
Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется небольшими молекулами
РНК, которые взаимодействуют с особым участком плазмиды, расположенным
поблизости от точки инициации репликации. Начавшись, репликация идет в
одном направлении и заканчивается вблизи точки инициации. Генетики,
стремящиеся максимально увеличить выход белков, кодируемых клонированными
в pBR322 генами, получали мутанты с модифицированными РНК. У некоторых
таких мутантов числа копий плазмиды составляет более 100, что приводит к
существенному увеличению выхода продуктов, кодируемых клонированными
генами. Интересная особенность репликации ColEl и pBR322 заключается в
том, что она полностью обеспечивается ферментами хозяина. Сами плазмиды
не несут информации, нужной для кодирования ферментов репликации.
Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, к хромосомы Е. coli
- с другой, различаются тем, что первый не подавляется хлорамфениколом,
который блокирует синтез белка. В присутствии этого соединения репликация
хромосом прекращается по завершении уже начавшегося раунда репликации.
Такого подавления репликации pBR322 не происходит, и: плазмиды
накапливаются в обработанных хлорамфениколом;
20-1344
306-
Глава 7
клетках, так что в конечном счете они составляют до 50% всей ДНК. При
выделении плазмид для увеличения выхода плаз-мидной ДНК к культуре за
несколько часов до сбора клеток иногда добавляют хлорамфеникол.
Инициация репликации плазмиды R1 Е. coli регулируется белком-репрессором,
