Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 2" -> 94

Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.

Айала Ф. , Кайгер Дж. Современная генетика. Том 2 — М.: Мир, 1988. — 368 c.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetikat21988.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 164 >> Следующая

расщепления для большей наглядности изображены здесь в виде двух наборов
дискретных 5'-и З'-концевых фрагментов. В действительности,
индивидуальные фрагменты как таковые идентифицируют только после
клонирования и определения нуклеотидной последовательности, как показано
на схеме (стадии 2 и 3). На стадии 2 к концам каждого из фрагментов в
смеси присоединяют Ват HI-линкеры и проводят встраивание в вектор pBR322
по Ват Н1-сай-ту. После этого индивидуальные фрагменты могут быть
получены с помощью клонирования рекомбинантных плазмид в Е. coli, как
обсуждалось в гл. 9 (стадия 3).
Мутагенез in vitro с введением линкерных вставок
ДНК нормального гена tk Регуляторная область i Кодирующая область
Стадия 1
Экзонуклеаза III удаляет
нуклеотиды с З'-конца ^
-3'
"5'
Нуклеаза SI
U
ft
Нуклеаза S1 атакует одноцепочечную ДНК
Набор З'-концевых фрагментов, содержащих дистальные участки регуляторной
области
С
Экзонуклеаза III
Набор З'-концевых фрагментов, содержащих проксимальные участки
регуляторной области
I Кодирующая область
Стадия 2
К концам фрагментов каждого набора присоединяют линкер, содержащий 10
п.н.
(в данном случае Ват HI - линкер) и включающий сайт рестрикции,
отсутствующий в ДНК гена tk дикого типа
1

'-2


1'
Все фрагменты расщепляют рестриктазой Ват HI для создания липких концов и
клонирования в векторе pBR322 по Baw HI-сайту
Стадия 3
Клонирование позволяет выделить индивидуальные фрагменты в чистом виде и
идентифицировать их с помощью определения нуклеотидной последовательности
Стадия 4
Рекомбинацией in vitro индивидуальных фрагментов из 5 *концевого и 3
'концевого наборов по Bam HI-сайту можно получить целый ряд различных
мутантных генов tk
Регуляторная область [ Кодирующая область
и образует нуклеосому, имитирующую естественный субстрат для транскрипции
в ядре.
Хорошим примером применения такого подхода является мутационное
картирование регуляторных последовательностей, необходимых для
транскрипции гена тимидинкиназы (tk) вируса герпеса. Этот ген может
-120 -100 - 80 - 60 - 40 - 20 cap
I | I I I I I I I I
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TCTCATTCGC GAATTCGAAC ACGCAGATCC
AGTCGGGGCC GCGCGCTCCC AGGTCCACTT CGCATATTAA
CCCGGATCCG GCAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATCC
AGTCGGGGCG GCCCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGCCGGA TCCGGCCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATCC
AGTCGGGGCG GCCCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC CGGATCCGCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCGGA TCCGGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCCGCA TCCGGTTCGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATCCGC ATCCGGGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC CCGGATCCGG ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC CCCGGATCCG GCGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
G
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC CCGGATCCGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
ACCGGATCCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCCCGGAT CCGGGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCCCCGGATC CGCTCCACTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCCCGGTCCC GGATCCGGTT CGCATATTAA
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CCCGGATCC
С
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CCCATATTAC GCATCCGGCTGTGGCCTCGA
ACACCGAGCG ACCCTGCAGC
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGCCGGAT CCCGCCTCGA
ACACCGAGCG ACCCTGCAGC
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGCCGGATC
CGGCCGAGCG ACCCTGCAGC
CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC
AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA
ACACCCCGC ATCCGGCAGC
Рис. 16.3. Мутантные гены f/c, полученные, как показано на рис. 16.2.
Нормальная последовательность соответствующей области гена tk приведена в
верхней строке (показана только последовательность некодирующей цепи).
Встраивание в эту последовательность Ват HI-линкера на различных участках
приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом.
Эффективность транскрипции для каждого из мутантных генов указана в табл.
16.2 (По McKnight S.L, Kingsbury R., 1982. Science 217, 316.)
GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC GGTGACGCGT GTGGCCTCGA
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed