Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
хромосоме клетки-хозяина (рис. 14.13). С другой стороны, когда в
лизогенной
Рис. 14.13. Транскрипция области int-xis генома фага X контролируется
двумя различными промоторами. При лизогенизации образуется только
интеграза, необходимая для встраивания фаговой ДНК в хромосому Е. coli.
При этом белок с ell активирует транскрипцию гена int с
промотора pj, расположенного внутри гена xis. В ходе индукции профага
транскрипция обоих генов int и xis инициируется с промотора pL.
Синтезируются одновременно и интеграза, и эксцизионаза, необходимые для
вырезания фага из хромосомы.
Экспрессия генетического материала
клетке происходит индукция профага, транскрипция генов int и xis
происходит с общего промотора pL. Нарабатываются белки, продукты генов
int и xis, которые направляют рекомбинационную эксцизию профага из
хозяйской хромосомы. (Вся совокупность этих и других явлений,
составляющих основу жизненного цикла фага X, будет специально разобрана в
гл. 15.)
Пониманию деталей молекулярного механизма int-зависимой рекомбинации
способствовало изучение этого процесса in vitro, а также установление
первичной структуры участков POP' и ВОВ' и рекомбинантных участков ВОР' и
РОВ'. Все эти участки характеризуются наличием общего центрального
фрагмента (кора, от англ. core-сердце-вина) протяженностью 15 п.н., на
котором и разыгрываются основные рекомбинационные события (рис. 14.14).
Каждое из плеч (Р, Р', В и В') характеризуется особой, отличной от других
плеч нуклеотидной последовательностью. Функциональное значение этих
участков последовательности исследовали в рекомбинационной системе in
vitro, содержащей очищенную интегразу и необходимые клеточные белки. В
этой системе можно наблюдать рекомбинацию участков POP' и ВОВ',
встроенных в сверхскрученную ДНК плазмиды pBR322, с помощью методов,
обсуждавшихся в гл. 9. С использованием клонированных фрагментов,
содержащих делении разной величины в том или ином из плеч Р, Р', В и В',
удается определить необходимый для рекомбинации минимальный размер
функциональных участков, окружающих общую кор-последовательность. Было
установлено, что функциональный участок POP' содержит по 240 п. н. с
каждой стороны от кора. В то же время функционально необходимый участок
ВОВ' по размеру не намного превышает саму 15-нуклеотидную кор-
последовательность. Участки нуклеотидной последовательности, с которыми
специфически связывается интеграза фага X, были идентифицированы с
помощью так называемого "футпринтинга" (от англ. footprint - след ноги;
см. Дополнение 14.2). В связывании участвуют центральная область POP'
протяженностью 34 п.н., включающая кор, а также два участка
последовательности в плече Р и один, более протяженный, в плече Р'. С
другой стороны, единственный участок узнавания на хромосоме представляет
собой последовательность из 20 п. н., включающую область кора ВОВ'.
Вследствие различий в структуре плечевых участков фагового и хозяйского
att-сайтов рекомбинантные сайты РОВ' и ВОР' в функциональном отношении
отличаются от POP' и ВОВ'. Это отличие несомненно и проявляется в том,
что интеграза, направляющая процесс встраивания профага, сама по себе
оказывается неспособной катализировать обратную реакцию, для
осуществления которой необходимо участие дополнительного белка - продукта
гена xis.
Механизмы встраивания и вырезания профага пока в точности не известны.
Установлено, что очищенная интеграза обладает топоизоме-разной
активностью. Она делает одноцепочечный разрыв в суперскру-ченной ДНК,
благодаря чему осуществляются свободное вращение и удаление супервитков.
Вслед за этим интеграза направляет замыкание фосфодиэфирной связи без
использования каких-либо дополнительны? источников энергии. Считают, что
энергия первоначально расщепленное связи сохраняется благодаря
ковалентному связыванию высвободившейся 5'-фосфатной группы с самой
интегразой. Известно, что при рекомбинации между POP' и ВОВ' образуется
очень короткий участок ге
POP
" TTCAGCTTTTTTATACTAAGTTG AAGTCGAAAAAATATGATTCAAC
'/Ш4444444441444444444
BOB
" GCCTGCTTTTTTATACTAACTTG CGGACGAAAAAATATGATTGAAC
BOP'
: 1
TTCAGCTTTTTTATACTAACTTG AAGTCGAAAAAATATGATTGAAC
'/4444444444444444444444
GCCTGCTTTTTTATACTAAGTTG
CGGACGAAAAAATATGATTCAAC
POB'
44444444444444/4444
r
Рис. 14.14. Нуклеотидные последовательности внутри и вокруг общего 15-
нуклеотидного кора (выделены жирным шрифтом) участков POP' и ВОВ', а
также рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'. Отмечены гетеродуплексные
области ДНК на участках ВОР' и РОВ', образующиеся в результате inf-
зависимой рекомбинации. (По Mizuuchi К. et al., 1981. Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 45, 429-437.)
L/1
L/i
14. Рекомбинация
156
Экспрессия генетического материала
теродуплексной ДНК, а два одноцепочечных разрыва возникают в разных
точках внутри общей кор-последовательности. Как показано на рис. 14.14,
расстояние между точками разрыва составляет 7 п.н. На основании данных
