Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 2" -> 50

Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.

Айала Ф. , Кайгер Дж. Современная генетика. Том 2 — М.: Мир, 1988. — 368 c.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetikat21988.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 164 >> Следующая

трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5'
З'-экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно
высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е.
получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью
(оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки
in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-транс-
ляции, могут использоваться при скрининге библиотек рекомбинантных ДНК
для обнаружения клонов, содержащих комплементарные последовательности
ДНК, или для идентификации соответствующих фрагментов рестрикции ДНК
после электрофоретического разделения в геле (см. гл. 9). В присутствии
двухцепочечной ДНК, содержащей одноцепочечный разрыв фосфодиэфирной
связи, и меченых дезоксирибонуклеозидтрифос-фатов ДНК-полимераза I
направляет одновременно включение радиоактивных предшественников в
растущую цепь и деградацию немеченой цепи ДНК (рис. 13.8). Двухцепочечную
меченую ДНК затем денатурируют тепловой или щелочной обработкой и
получают одноцепочечный зонд.
114
Экспрессия генетического материала
Рис. 13.8. Синтез in vitro радиоактивной цепи ДНК (цветная линия) при
действии ДНК-полимеразы I. Совместное действие полимеризационного и
экзонуклеазного центров (см. рис. 13.7) приводит к перемещению
одноцепочечного 3'-0Н/5'-Р04-разрыва вокруг показанной на рисунке
кольцевой матричной цепи. Поэтому данный процесс называется ник-
трансляцией (т.е. перемещением разрыва).
Pol I dNTP
v
Pol I dNTP
Помимо этого ДНК-полимераза I является необходимым компонентом важнейшего
метода определения последовательности ДНК, который называют "методом
терминации цепи". Для установления последовательности ДНК, как
обсуждалось в гл. 9, необходимо получить серии радиоактивно меченых
перекрывающихся фрагментов, причем в рамках каждой серии все фрагменты
должны начинаться с одной общей точки и статистически распределяться по
длине таким образом, чтобы на противоположном конце каждого фрагмента
находилось основание одного определенного (для данной серии) типа-А, Т, G
или С. В этом методе серии перекрывающихся фрагментов получают с помощью
ДНК-полимеразы I по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием
небольшого затравочного олигонуклеотида (праймера), комплементарного
определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозид-
трифосфатов. Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции
полимеризации, при этом каждый раз
в реакционной смеси содержится некоторая доля одного из четырех
дмдезоксири-бонуклеозидтрифосфатов, встраивание которых вызывает
терминацию роста цепи, что обусловлено отсутствием у встроившегося
нуклеотида З'-ОН-группы, необходимой для осуществления следующего этапа
элонгации. Например, в реакционной смеси, содержащей диде-
зоксиаденозинтрифосфат и четыре дезок-сирибонуклеозидтрифосфата, в каждое
положение растущей цепи, соответствующее остатку тимина в матричной цепи,
будут конкурентно включаться и дезоксиа-денозин, и дидезоксиаденозин. В
тех случаях, когда будет происходить включение дидезоксиаденозина,
дальнейший рост цепи на данной матрице будет уже невозможен. При
включении дезоксиаде-нозина полимеризация будет продолжаться без помех
вплоть до следующего матричного остатка тимина, где вновь с некоторой
вероятностью может произойти включение дидезоксиаденозина, приводящее к
терминации цепи. Таким образом может быть получена серия всех
Клонирующий вектор М13 со вставочной последовательностью
Бляшки фага Ml 3, несущего вставочную последовательность
Из отдельной бляшки получают культуру фага, выделяют фаговую
одноцепочечную ДНК
V
Добавляют затравку, комплементарную последовательности М13, примыкающей к
вставке
Основание
Р~р~"р-
Pol I
Основание
ОН Н
Радиоактивный dNTP
did АТР
didTTP
didCTP
didGTP
Нагревают для отделения наборов перекрывающихся фрагментов от матрицы.
Фракционируют фрагменты с помощью I электрофореза ф
I
V
- С
V
Л
Рис. 13.9. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с
помощью клонирования на фаге М13 и последующего использования метода
терминации цепи с применением фрагмента Клёнова ДНК-по-
лимеразы I. Сравните строение обычных де-зоксирибонуклеозидтрифосфатов
(dNTP) и терминирующих дидезоксирибонуклеозид-трифосфатов (didNTP).
116
Экспрессия генетического материала
возможных перекрывающихся фрагментов, начинающихся с праймерного участка
и статистически обрывающихся на З'-концевом остатке А.
Данный способ определения последовательности ДНК наиболее эффективно
применяется для рестрикционных фрагментов ДНК, встроенных в
двухцепочечную репликативную форму клонирующего вектора,
сконструированного на основе одноцепочечной ДНК фага М13. Выделение
фаговых частиц, образующихся после трансфекции полученным таким образом
двухцепочечным рекомбинантным фаговым геномом, служит непосредственным
источником кольцевых одноцепочечных ДНК-матриц, которые используют для
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed