Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
роли затравки для присоединения следующего нуклеотида. Цепи ДНК в
предложенной Уотсоном и Криком структуре двойной спирали антипараллельны,
то есть в области репликативной вилки присутствуют и 3'- и 5'-концы
синтезируемых цепей. Как уже упоминалось, для действия ДНК-полимеразы
необходимо наличие З'-ОН-затравки, и поэтому только одна из двух растущих
цепей ДНК (ведущая цепь) может синтезироваться непрерывно. Синтез другой
(отстающей) цепи идет прерывисто (рис. 13.1, А). Экспериментальные
данные, свидетельствующие о прерывистом характере роста в репликативной
вилке одной из цепей, были получены с помощью пульсового введения метки
3Н-тимидина в синтезируемую в клетках ДНК. Если перед экстракцией ДНК из
клеток они находились в контакте с радиоактивным субстратом лишь в
течение нескольких секунд, то оказывается, что значительная часть
новосинтезированной ДНК (идентифицируемой по содержанию радиоактивности)
при щелочной денатурации распадается на ряд небольших одноцепочечных
фрагментов длиной около 1000-2000 нуклеотидов. Они получили название
фрагментов Оказаки, по имени Рейджи Оказаки, впервые обнаружившего эту
особенность репликации ДНК. Если пульсовое введение 3Н-тимидина прерывают
перенесением растущих клеток на обычную среду, не содержащую меченых
предшественников, и подращивают клетки в течение нескольких минут (метод
тульс-чейз"), то радиоактивность обнаруживается уже в составе весьма
протяженных фрагментов ДНК (рис. 13.2).
Поначалу тот факт, что "отстающая" цепь ДНК синтезируется не непрерывно,
представлялся весьма удивительным, поскольку неясно было, откуда всякий
раз берутся новые затравки ("праймеры"). Как известно, для работы ДНК-
полимеразы необходимо наличие З'-ОН-затравки, без которой фермент не
способен направлять рост цепи. Так, очищенная ДНК-полимераза оказывается
абсолютно неактивной в смеси, содержащей кольцевую одноцепочечную ДНК
фага фХ174 в качестве матрицы и необходимые субстраты. В то же время, как
мы знаем, РНК-полиме-раза может инициировать синтез РНК по одноцепочечной
ДНК-матри-це в отсутствие какой бы то ни было затравки.
Это свойство РНК-полимеразы подтверждается, как отмечалось в гл. 11, тем,
что на 5'-конце синтезируемых молекул РНК содержится трифосфатная
группировка. Впоследствии было установлено, что на 5'-конце фрагментов
Оказаки находятся участки РНК. Это указывает на участие РНК-полимеразы в
образовании РНК-затравок при репликации
106
Экспрессия генетического материала
Б
Синтез РНК-затравки ДНК-фрагменты Оказаки
Деградация РНК-затравки
5' 3'1
Следующий цикл
ДНК-лигаза зашивает одноцепочечный разрыв
Белок SSB
Белок SSB
0Й т
-5'
-3'
Топоизомераза
Рис. 13.1. А. В репликативной вилке особенности синтеза каждой из двух
цепей ДНК зависят от полярности цепи. Синтез ведущей цепи в направлении
5'->3' происходит непрерывно. Для синтеза отстающей цепи с
противоположной полярностью необходимо постоянное образование новых
затравочных участков. Б. Отстающая цепь синтезируется относительно
небольшими фрагментами (фрагменты Оказаки), для инициации которых
необходимо предварительное образование коротких РНК-затравок (праймеров).
РНК-затравочный участок одного фрагмента ДНК удаляется после того, как
завершается синтез следующего фрагмента. Разрыв между двумя фрагментами
закрывается благодаря действию ДНК-лигазы. В. Участие хе-ликазы, SSB-
белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, и топоизомеразы в расплетании
двойной спирали родительской ДНК при движении репликативной вилки. (По
Alberts В., Stemglanz R, 1977. Nature, 269,
655.)
13. Генетический контроль синтеза ДНК
107
А
Содержание радиоактивных фрагментов ДНК во фракции
12 3 4
Дно пробирки
Г 7
Рис. 13-2. Эксперимент, подтверждающий модель, согласно которой часть
новообразованной ДНК Е. coli состоит из небольших одноцепочечных
фрагментов, которые в дальнейшем включаются в состав протяженных цепей.
Черная кривая отражает распределение по размерам одноцепочечных
фрагментов ДНК, наблюдаемое при пульсрвом введении метки и последующем
центрифугировании в сахарозном градиенте плотности при pH 12 для
предотвращения образования водородных связей между комплементарными цепя-
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Фракции ВеРх пробирки
Направление седиментации
ми. Небольшие фрагменты, содержащиеся в пике, расположенном в верхней
части центрифужной пробирки, через некоторое время после удаления из
среды радиоактивных предшественников (период "чейз") оказываются
включенными в состав протяженных одноцепочечных участков (цветная линия).
Разделение основано на том, что большие по размеру одноцепочечные цепи
характеризуются более высокой скоростью седиментации, чем небольшие
фрагменты.
ДНК. Эту РНК-полимеразу, отличающуюся от ферментов, которые
непосредственно участвуют в процессе транскрипции, называют прайма-зой.
РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После
реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за
