Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 2" -> 22

Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.

Айала Ф. , Кайгер Дж. Современная генетика. Том 2 — М.: Мир, 1988. — 368 c.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetikat21988.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 164 >> Следующая

Pvull 474 CAG/CTG
Asul 867 G/GACC
Mnll 325, 444, 447, 892, 914, 929, 943, 1014, 1085, CCTG
1103, 1159 или GAGG
11 Отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз НаеII, ffmdll, ffindlll, Я
fail, Hpall, EcoRl, Aval, BamI, Ball, Bglll, Smal, Xhol и Sail.
21 Приведены номера, соответствующие положению первого (5'-) нуклеотида в
узнаваемой последовательности, а не точке расщепления. Для случаев, когда
расщепление происходит внутри узнаваемой последовательности, положение
соответствующей точки помечено косой чертой. (По Me Reynolds L. et. al.
1978. Nature, 273, 723.)
мРНК состоит из 1872 нуклеотидов, что значительно больше, чем необходимо
для кодирования аминокислотной последовательности оваль-бумина.
Овальбуминовая мРНК содержит транслируемый участок из 1158 нуклеотидов,
заключенный между нетранслируемыми фланкирующими 5'- и З'-участками, а
также некодирующий "хвост" poly А на З'-конце. Двухспиральная ДНК-копия
(кДНК) молекулы мРНК синтезируется in vitro с помощью обратной
транскриптазы и после встраивания в подходящий плазмидный вектор
клонируется в Е. coli. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида
pOV230 содержала в качестве вставки кДНК, соответствующую остаткам 13-
1872 исходной мРНК. Была определена нуклеотидная последовательность кДНК-
фрагмента гибридной плазмиды и составлена карта расположения на ней
сайтов узнавания ферментами рестрикции. Соответствующая
последовательность мРНК, выведенная из последовательности кДНК, показана
на рис. 11.18, а список сайтов расщепления к ДНК рестриктазами приведен в
таблице 11.1. Здесь существенно отметить, что в овальбуми-новой кДНК
отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз EcoRI и ЯшсПИ и имеется один
сайт расщепления НаеIII по остатку 818.
После расщепления очищенной плазмиды pOV230 рестриктазами Hin dill и Нае
III кДНК можно отделить от плазмидной ДНК в виде
58
Экспрессия генетического материала
Рис. 11.19. А. Рестрикционная карта участка плазмиды pOV 230, содержащего
овальбуми-новую кДНК, и сопоставление с овальбуми-новой мРНК. Б.
Полученные при расщеплении рестриктазами Hin dill и Haelll фрагменты OVL
и OVR могут быть очищены с помощью электрофореза в агарозном геле.
Векторная часть плаз-мидной ДНК (рМВ9) при этом расщепляется на много
мелких фрагментов, мигрирующих гораздо быстрее, чем OVL и OVR. После
извлечения из агарозного геля фрагменты OVL и OVR могут быть получены в
чистом виде. (По Lai Е. et al. 1978. Ргос. Nat. Acad. Sci. USA, 75,
2205.)
двух фрагментов, содержащих 1150 и 1450 нуклеотидов (рис. 11.19). Меньший
фрагмент содержит кДНК, соответствующую 5'-концевому участку, а больший
фрагмент - З'-концевому участку мРНК. С помощью ник-трансляции, используя
ДНК-полимеразу I Е. coli (см. гл. 13) и а-32Р-
дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в каждый из этих фрагментов можно ввести
радиоактивную метку in vitro. Помеченные таким образом до очень высокой
удельной активности фрагменты кДНК можно нагреванием перевести в
одноцепочечную форму и использовать в качестве зондов для идентификации
комплементарных фрагментов, содержащихся в денатурированной суммарной ДНК
куриного генома.
Поскольку кДНК, полученная по овальбуминовой мРНК, не содержит Есо RI-
сайтов, то можно было бы ожидать, что при расщеплении тотальной куриной
ДНК рестриктазой EcoRI образуется только один фрагмент ДНК, содержащий
последовательность, комплементарную кДНК (в куриной ДНК имеется множество
сайтов для Есо RI, так что какие-то два из них наверняка окажутся по
каждую сторону овальбуми-нового гена). Такой фрагмент может быть
идентифицирован с помощью гель-электрофоретического разделения по размеру
фрагментов куриной геномной ДНК, расщепленной Есо RI, денатурации
фрагментов и последующей гибридизации с денатурированным меченым кДНК-
зон-дом (рис. 11.20). Осуществление такого эксперимента дало весьма
неожиданные результаты. Оказалось, что не один, а четыре фрагмента
различной длины содержат последовательности, комплементарные тому
5'К-
Овальбуминовая мРНК -1,85-----------------
-^3'
| ААА
'0,3'
POV230 Овальбуминовая ДНК
----------1,95----------
Я/nd 111 К-
Рз(1
Нае III
- 1,15 - (OVL)
*ТТ РМВ9
-1,45 - (OVR)
Нае III
OVr 1,45 тли.
OVj^ 1,15 тли.
со
03
>J ПО > > О ООО,
Передача информации в клетках
59
ос
ь
"н * "н > > > обо
9,5 тлл,-
4,2 хлл. -2,4 тлл. -1,8 тлл. ¦
Рис. 11.20. Изображение радиоавтограммы, полученной после расщепления
суммарной куриной ДНК ре-стриктазой EcoR 1, электрофоретического
разделения в агарозном геле, переноса по Саузерну и гибридиза-
ции с радиоактивными зондами, полученными на основе фрагментов OVL и OVR
по отдельности и в смеси. (По Lai Е. et al. 1978. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 75, 2205.)
или иному из двух кДНК-зондов (рис. 11.20). Это может означать только то,
что в истинный овальбуминовый ген входят участки последовательности,
содержащие сайты узнавания для ?со RI, которые не включаются в
последовательность мРНК. Эти четыре Есо RI-фрагмента отмечены на карте
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed