Современная генетика. Том 2 - Айала Ф.
ISBN 5-03-000495-5
Скачать (прямая ссылка):
использован для встраивания генетического материала китайского хомячка в
клетки мыши. На рисунке клетки мыши содержат дефект в гене HPRT.
Трансформированные клетки мыши, выросшие на среде HAT, должны содержать
ген HPRT хомячка. (По Klobutcher Z. А., Ruddl F.H., 1981. Annu. Rev.
Biochem., 50, 533-554.)
(19,21,22)
g i
4) О H Q.
8 *
E
о
Относительный уровень флуоресценции
/Клетка китайского \s хомячка (HPRT+)
Задержка митоза
Выделение хромосом
Реципиентная клетка мыши HPRT"
Селекция HAT
V
Клетка мыши,трансформированная геном HPRT+ китайского хомячка
Генетика соматических клеток: картирование генома
307
Хромосома реципиентной клетки
А - I В
Селектируемый
ген (SG)- I
С-|
Стабилизация
Образовавшиеся хромосомы
А-
SG-
Хромосома Клон Клон Клон
донорной клетки j 2 3
Рис. 18.15. Для картирования генов после трансфекции необходима
цитологическая идентификация перенесенного фрагмента хромосомы в клетках,
отобранных по активности исследуемых генов. В различных клеточных линиях
могут находиться фрагменты разной длины.
ванных фрагментов данной хромосомы, различающихся по величине, можно
определить синтению и порядок генов. Естественно, это возможно тогда,
когда гены, отсутствующие в малых фрагментах, выявляются при встраивании
фрагментов большего размера (рис. 18.15).
Кроме такого прямого подхода, порядок генов и их относительное сцепление
можно изучать по частотам котрансформации этих генов. Такие эксперименты
сводятся к измерению частот совместного встраивания в геном одной клетки
двух разных генов. Гены, кодирующие галак-токиназу (GALK), растворимую
тимидинкиназу (ТК1), и проколлаген 1 (COLM), расположены в длинном плече
хромосомы 17 (рис. 18.16). При исследовании линий, трансформированных по
маркеру ТК1, определено, что частота котрансформации для GALK равна 19%
(5 из 27 трансформантов). Для COLM частота котрансформации с ТК1 равна
74% (20 из 27). Отсюда следует, что ген ТК1 расположен на хромосоме 17
ближе к гену COLM, чем к GALK. Расстояния между генами могут быть
рассчитаны в единицах переноса генов, опосредованного хромосо-
, COLM "
GALK % TK 1
i
| 26 единиц------1-26 единиц 1
I------------------81 единица--------------------1
Рис. 18.16. Карта сегмента хромосомы 17 человека, построенная по
результатам переноса генов в составе транслоцированных фрагментов
хромосомы. (По Klobutcher Z. A., Ruddle Е.Н., 1981. Annu. Rev. Biochem.,
50, 533-534.) Дополнительные данные указывают на то, что локус COLM
находится вне фрагмента GALK-ТК1.
308
Экспрессия генетического материала
мами (ПГОХ). Расстояние в одну единицу соответствует частоте
котрансформации в 99%. Тогда в этих единицах расстояние между генами ТК1
и COLM равно 100 - 74 = 26, а между ТК1 и GALK-100 - 19 = 81. Сами по
себе эти цифры ничего не говорят о взаимном расположении исследуемых
генов, но данные о том, что ТК1 иногда котрансформи-руется с GALK, не
захватывая COLM, указывают на то, что порядок этих генов следующий: GALK-
TK1 -COLM.
Картирование генов с помощью ДНК-зондов
Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были
основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток. Гены,
кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены,
кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса
гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому
условию. Гены, не обладающие подобным фенотипическим проявлением, не
могут быть картированы лишь с использованием описанных методов. Это
ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При
этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для
которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли
поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов
соматических клеток.
Первое применение методов работы с рекомбинантными ДНК для картирования
генов человека включало ДНК-гибридизацию в растворе. Таким образом,
удалось картировать гены а- и Р-глобинов. Зонды, представляющие собой
комплементарные ДНК (кДНК) этих генов, были получены с помощью обратной
транскрипции очищенных а- и Р-глобиновых мРНК. Эти зонды в определенных
условиях не взаимодействуют друг с другом или с глобиновыми генами мыши,
но образуют стабильные дуплексы при отжиге с соответствующими
последовательностями ДНК человека. Глобиновые кДНК-зонды использовали для
тестирования в растворе препаратов ДНК, выделенных из различных гибридных
клонов. Образование стабильного дуплекса между кДНК-зондом и ДНК
исследуемого препарата свидетельствовало о присутствии человеческих
глобиновых генов в геноме соответствующей гибридной линии.
Кариологический анализ выявленных таким образом гибридных клонов позволил
заключить, что гены р-глобинового семейства расположены в хромосоме 11, а
а-глобиновые гены-в хромосоме 16.
Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое
количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью
