Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
ДНК
Рис. 9.1. Последовательные этапы денатурации и ренатурации фрагментов
ДНК. Ренатурации требует осуществления двух отдельных реакций: (1)
нуклеации - образования водородных связей между двумя одноцепочечными
фрагментами; это бимолекуляр-
ная реакция, т. е. реакция второго порядка; (2) застегивания, при которой
водородные связи образуются между всеми основаниями комплементарных
нитей; это мономолеку-лярная реакция, т. е. реакция первого порядка.
Организация и передача генетического материала
1,0 г
9 0,5 -
\
Начальное состояние \
1
с° 1 + кгс01 Реакция прошла половину \
\
Конец реакции
Nls
\'-
\
I I I I nil 1 I i I Mill kj I I I lXl
I V M-mJ
0,01 0,1 I 10
Начальная концентрация • время, c0t (логарифмическая шкала)
100
Рис. 9.2. Кинетика идеальной реакции второго порядка при к2 = 1. По
ординате отложена доля одноцепочечных фрагментов в реакционной смеси по
прошествии t секунд от на-
чала реакции. По абсциссе отложена величина c0t, где с0-начальная
концентрация одноцепочечной ДНК в молях нуклеотидов на литр.
ным цепям комплементарными основаниями; остальные взаимно комплементарные
основания выстраиваются друг против друга. На данной стадии происходит
образование связи между двумя разными одноцепочечными молекулами. Это
реакция второго порядка, ее скорость пропорциональна квадрату
концентрации ДНК. Вторая стадия - реакция "застегивания молнии", при
которой устанавливаются водородные связи между выстроенными друг против
друга комплементарными нуклеотидами. Эта стадия представляет собой
мономолекулярную реакцию; скорость образования водородных связей
пропорциональна концентрации ДНК, т. е. кинетически является реакцией
первого порядка. Какая из этих двух стадий идет медленнее и,
следовательно, определяет общую скорость ренатура-ции ДНК, должен решать
эксперимент. Показано, что лимитирующей является стадия образования
первых связей между цепями.
Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции
ренатурации описывается гиперболической функцией (вывод формулы
приводится в дополнении 9.1). График зависимости концентрации от времени
при к2 = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени
(t1/2), необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК
(с/с0 = 0,5), можно определять показатель реакции ренатурации (с0(1/2).
Эта величина прямо пропорциональна числу нуклеотидов в неповторяющейся
последовательности ДНК. Эта закономерность иллюстрируется на рис. 9.3 для
нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы
можем определить общий объем уникальной генетической информации,
кодируемой ДНК, измеряя значение e0f, ,2 ! Более того, экспериментально
определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в
геноме повторяющейся генетической информации.
На рис. 9.4 сравниваются кинетика ренатурации ДНК прокариот и эукариот.
Обратите внимание на то, что кривая ренатурациии ДНК Е. coli
14
10
Число нуклеотидных пар (сложность ДНК)
4 103 4 104 10s4 Ю6 4
103 -I-
104
Ч-
107
10s
-I-
10
ю10
ч
1,0
! 0,5
1(Г2 10'
СоДмоль • сек/л)
Рис. 9.3. Взаимозависимость между экспери- ном значении с0 время,
необходимое для ре-ментально определенными значениями c0t1/2
и сложностью (N) использованных в эксперименте фрагментов ДНК. При
фиксирован-
натурации половины молекул, пропорционально N. [Britten R. J., Kohne D.E.
(1968). Science, 161, 529.]
с" t (моль • сек/л 1
Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. coli и
фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. coli очень близка к
теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то,
что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении
константы скорости реакции к2. Напротив, график кине-
тики ДНК коровы по форме качественно отличается от изображенного на рис.
9.2. ДНК теленка содержит последовательности рена-турирующие как быстрее,
так и медленнее последовательностей ДНК Е. coli.
[Britten R.J., Kohne D.E. (1968). Science, 161, 529.]
264
Организация и передача генетического материала
Рис. 9.5. На рисунке в виде спектра изображена частота
последовательностей ДНК мыши с различной повторностью. Число ко- Ьй
пий каждого типа по- сз
следовательности |
оценивали по кинетике *
ренатурации ДНК мы- ?
ши. 5
I
почти тождественна теоретической кривой, представленной на рис. 9.2. Так
как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что
скорость реакции второго порядка к2 неизменна, это означает, что ре-
натурация фрагментированной ДНК Е. coli характеризуется определенным
значением к2. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты
ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренатурации
фрагментированной ДНК Е. coli, тогда как остальная ДНК (около 60%)
ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можно заключить,
что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как
