Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
перейдет вся Hfr-хромосома, то клетка-реципиент сохганит F--тип.
F* -клетка
Hfr-клетка
Включение F-фактора
У
Hfr -клетка
1~-клетка Hfr-клетка
В Перенос одноцепочечной ДНК по механизму ''катящегося кольца"
Скрещивание 1: Hfr, Thr + Leu + Strs xF', Thr - Leu " StrR
Результат: колонии образуют лишь рекомбинанты Thr + Leu+ StrR.
Скрещивание 2: Hfr, Thr- Leu- StrRxF-, Thr+ Leu+ Sti5.
Результат: колоний нет.
Первое скрещивание показывает, что применение стрептомицина устраняет
колонии, которые в противном случае образовались бы из клеток родителя
Hfr. Формировать колонии могут только рекомбинанты дикого типа, поскольку
родители F - -типа не могут расти на минимальной среде в отсутствие
треонина и лейцина. Второе скрещивание показывает, что для образования
рекомбинантов необходима жиз-
Организация и передача генетического материала
неспособность родителя F ", а не Hfr. Рекомбинантные колонии StrR не
образуются, поскольку ген strR локализован слишком далеко от сайта, с
которого начинается передача хромосомы и потому почти никогда не попадает
в F"-клетку.
То, что поступление бактериальных генов из Hfr в F " -клетку происходит
последовательно, всегда начиная с сайта интеграции F-фактора в
бактериальную хромосому, дает возможность картировать гены по порядку их
попадания в F " -клетку (подробнее мы обсудим это в следующем разделе).
Как показано на рис. 8.5, проникновение хромосомы в F " -клетку всегда
начинается с нуклеотидной последовательности интегрированного F-фактора.
При этом в F- -клетку поступает не весь F-фактор. Для того чтобы в клетку
попала оставшаяся его часть, необходимо, чтобы в F" перешла вся Hfr-
хромосома. Это случается очень редко из-за спонтанных разрывов
конъюгационной трубки, и поэтому большинство отбираемых рекомбинантов
остаются принадлежащими F " -типу.
Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации
Последовательное поступление генов из Hfr в F " -клетки представляет
возможность картировать их в бактериальной хромосоме в соответствии с
порядком и временем их попадания в клетки. Рассмотрим, например,
следующее скрещивание.
Скрещивание 3: Hfr, Thr+ Leu+ Azs Tls Lac + Gal +, Strs x F", Thr" Leu-
AzRTlRLac- Gal- StrR
0 10 20 30 40 50 60
Продолжительность конъюгации (мин)
Рис. 8.6. Графики зависимости доли неселективных маркеров среди
отобранных рекомбинантов типа Thr + Leu + Str в скрещивании 3 от
продолжительности конъюгации. После прерывания конъюгации культуру
высевают на селективную среду. Эк-
страполяция графиков для частоты каждого из неселективных маркеров к оси
абсцисс дает время от начала конъюгации, по прошествии которого маркер
становится способен к рекомбинации с хромосомой F~ -клетки.
8. Бактериальный геном
237
Рис. 8.7. Схема, иллюстрирующая полярность переноса Hfr-хромосомы в
эксперименте с прерванной конъюгацией. К рекомбинации с хромосомой F " -
клетки способны лишь те гены Hfr-хромосомы, которые к моменту прекращения
конъюгации оказались в реципиент-ной F " -клетке.
Hfr
Конъюгация
10 мин
15 мин
20 мин
Скрещивание между указанными штаммами начинается со смешивания двух
культур в момент времени t = 0. Через последовательные интервалы времени
из смеси отбирают пробы и резко взбалтывают их на мешалке с тем, чтобы
разрушить конъюгационные трубки, соединяющие скрещивающиеся клетки. Затем
образец высевают на агар со стрептомицином, содержащий в качестве
источника углерода глюкозу. На этой среде отбираются рекомбинанты Thr+
Leu+ StrR. Соответствующие три маркера thr +, 1еи+ и strR, называются
селективными. Гены, обусловливающие чувствительность к азиду (azi), к
фагу Т1 (ton), гены утилизации лактозы (lac) и галактозы (gal) являются в
данном случае неселективными маркерами, поскольку среда, на которой
выращиваются клетки, не позволяет различать аллели этих локусов у
участвующих в скрещиваниях бактерий. Затем отобранные рекомбинанты Thr +
Leu + StrR пересевают на различные среды, с тем чтобы определить генотипы
этих рекомбинантов по неселективным маркерам. Частота соответствующих
аллелей откладывается на графике как функция от про-
238
Организация и передача генетического материала
должительности скрещивания (рис. 8.6). Полученные кривые показывают, что
различные неселективные маркеры Hfr становятся способны к рекомбинации с
хромосомой F " -клеток по истечении различного времени от начала
скрещивания (рис. 8.7). Экстраполяция частоты каждого маркера к нулю
указывает время попадания маркера в F--клетку (рис. 8.6). Эти данные
позволяют упорядочить гены по Hfr хромосоме, начиная от точки интеграции
F-фактора, и оценить физические расстояния между ними, измеряя эти
расстояния в минутах, прошедших с начала скрещивания.
Кольцевая форма генома Е. coli
Из одного F + штамма может возникнуть множество различных штаммов Hfr,
для каждого из которых характерна собственная локализация и ориентация F-
фактора в хромосоме бактерии (рис. 8.8). Это проявляется в описанных выше
