Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
различны, тем не менее понятия, используемые в генетике эукариот, могут
быть применены и к скрещиванию между фагами. Для этого необходимо
контролировать проникновение фаговых частиц каждого из двух родительских
генотипов в инфицированные клетки и время, отводимое на репликацию и
рекомбинацию. Когда эти два фактора контролируются, то есть скрещивание
осуществляется в определенных стандартных условиях, то можно определить
сцепление между генетическими маркерами и оценить частоту рекомбинации,
что позволяет строить генетические карты.
Отношения между перечисленными в табл. 7.2 мутациями фага фХ174
анализировали посредством двухфакторных и трехфакторных скрещиваний.
Двухфакторные скрещивания между супрессорчувстви-тельными мутантами
осуществляли следующим образом: культуру бактерий Su+ заражали двумя
мутантными штаммами фага с высокой множественностью (по 5 фаговых частиц
каждого типа на бактериальную клетку). Использование такой
множественности дает нам уверенность в том, что все клетки инфицируются
обоими фагами. После лизиса бактерий по числу негативных колоний на
индикаторной культуре, обладающей соответствующими Su + -генами,
определяли общее число фагов в потомстве. При скрещивании фаговых
мутантов susamber в качестве хозяина использовали штамм Suamber', при
скрещивании между SUSamber- и SUS0pa/-мутантами ИЛИ Между SUSamber И
SUS0Chre ИНДИКДТОрОМ служил бактериальный штамм с обоими генами Su+.
Число рекомбинантов дикого типа, возникающих при скрещивании, определяли
по числу негативных колоний на индикаторной культуре Su ", на которой
могли размножаться только фаги дикого типа. Частоты рекомбинации,
обнаруженные при скрещивании между этими мутантами фага фХ174,
представлены в табл. 7.3.
Для того чтобы определить, в каком порядке расположены описанные мутации
на генетической карте, использовали трехфакторные скрещивания. При этом
применялся метод, несколько отличный от описанного для трехфакторных
скрещиваний в гл. 5, поскольку в этом случае было необходимо отбирать
рекомбинантов дикого типа по двум
7. Геном вируса
201
Преобладающий класс
тельность -;-" г 1--------i--------Г Малочисленный класс
I
Последова----------------,-----------------------------------------------
- Преобладающий класс
тельность / ^
- Малочисленный класс
атА -н Исходное скрещивание tsC 4 + tsC
/ / >
4 атВ + + + 4
Кроссинговер
tsC атА 4 + + 4
>
+ 4 атВ tsC + 4
Реципрокное скрещивание
атА 4- + + 4 4
i- >
+ атВ tsC + 4 tsC
Кроссинговер
+ атА + tsC 4 4
i- / / >
Преобладающий класс
тельность <.... ¦- ----------------------------------------
Малочисленный класс
III
Последова"---------------7---------------------- > Преобладающий
класс
тельность --------------1------------------------------------------------
Малочисленный класс
IV tsC г атВ 4 4 4
Рис. 7.4. Пример использования слабосце-пленного неселектируемого маркера
при определении последовательности маркеров путем трехфакторного фагового
скрещивания. I и П-две возможные последовательности расположения трех
маркеров. Отбирают рекомбинантов дикого типа между атА и атВ, а затем по
генотипу в отношении неселективного маркера определяют правильную
последовательность. Например, если гены расположены в последовательности
I,
то большинство отобранных рекомбинантов дикого типа будет обладать
генотипом + + tsC. Для появления рекомбинантов с генотипом + + +
необходим двойной кроссинговер, и потому такие рекомбинанты встречаются
реже. Если же гены расположены в последовательности И, то частоты двух
рекомбинантных генотипов будут обратными. Для того чтобы подтвердить
правильность установленной последовательности генов, производят
реципрокное скрещивание.
маркерам. В описанной ранее ситуации никакого отбора в потомстве не
производилось и могли наблюдаться все восемь возможных комбинаций
генотипов. Рассмотрим изображенное на рис. 7.4 скрещивание amAtsC х атВ.
Если атА и атВ сцеплены друг с другом теснее, чем каждый из них с tsC,
что устанавливается в двухфакторных скрещиваниях, то tsC используют в
качестве неселектируемого маркера при анализе потомства от скрещивания на
Su-индикаторе при пермиссивной температуре. Потомки дикого типа в
отношении аллелей amber будут формировать негативные колонии независимо
от того, содержит их генотип tsC или соответствующий аллель дикого типа.
Доля фагов, несущих аллели tsC и tsC + среди рекомбинантов, позволяет
различить последовательности генов amAamBtsC и tsCamAamB. Если в
потомстве представлен преимущественно дикий тип, значит, гены расположены
в последовательности tsCamAamB. Если же большинство составляют
температурочувствительные фаги, значит, порядок расположения генов на
карте amAamBtsC. Последовательность, установленная таким скре-
Таблица 7.4. Частоты рекомбинации, наблюдаемые при трехфакторных
скрещиваниях мутантов фХ174*
Частота ц; t Преобладающий
рекомбинации щ ге"01ИП ок ^
