Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 1." -> 108

Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. Том 1. — М.: Мир, 1987. — 295 c.
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetika1987.djvu
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

хромосоме начинается с рекомбинантного клона kDm 1570, несущего ДНК из
хромомера ЗС11-12. Этот химерный фаг извлекается из библиотеки генов
дрозофилы посредством гибридизации с информационной РНК, выделенной из
слюнных желез личинок. Эта информационная РНК кодирует клейкий белок,
обозначаемый символом Sgs-4. Генетическое картирование мутаций,
затрагивающих Sgs-4, позволяет локализовать этот ген в полосе 3011-12
политенной хромосомы (рис. 9.16). Клонированная ДНК Sgs-4 гибридизирует с
ДНК из полосы ЗС11-12 политенной хромосомы, расположенной непосредственно
справа от левого края делеции Df (l)d-m75e19. Это можно показать,
используя разработанный Эдвином Сау-зерном метод перенесения
электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку, связывающую
одноцепочечные молекулы ДНК (блотинг по Саузерну; см. рис. 9.6). Затем на
эту пленку наносят радиоактивный зонд, что позволяет определить, какие из
фрагментов ДНК в геле комплементарны последовательности нуклеотидов
зонда. Этот метод схематически изображен на рис. 9.17.
Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме
которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеций, если
использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О нарушении нормальной
нуклеотидной последовательности в делетирован-ной хромосоме
свидетельствует изменение распределения сайтов рестрикции по сравнению с
ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между
двумя сайтами рестрикции нормальной ДНК, то расстояние между оставшимся
сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка
следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося,
чем был первый. На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для
определения нового распределения сайтов рестрикции.
На рис. 9.18, А представлены результаты опыта, в котором ДНК мух дикого
типа (Oregon-R) и Df(1 )dm1Sel9/Df(l)N6*i15 подвергали действию ЯшсПИ, а
затем сравнивали методом Саузерна, используя в качестве радиоактивного
зонда ДНК дрозофилы из клона )xDm2151. Обратите внимание на то, что
распределение сайтов рестрикции в обеих ДНК одинаково, так как ДНК
дрозофилы из >xDm 2151 комплементарна последовательности и нормальной
ДНК, и ДНК из хромосомы с де-лецией Df( 1 )dm15eig. (Обратите также
внимание на то, что, как это видно на рис. 9.16, в хромосоме с делецией
Df(1 )N6Ai15 отсутствует
19"
Df(ljN7П24-5 DffVN64'15
DjWm7!"">
1-3456 1234 5 6 7 89
Л Л A A
6 7 8 12-45-78-
Xho I
Sac I
1.0
,8+4,0 8,5 1,9 5,1 3,2 48|4- 7,3 5,0 9,5 1,3 2,2 3,5 53
1,7 4,7 8.9
1 H----------------------1-I-----------H 1------1-----------III! I------
----H------1--------
3,3 3,51,8 6,9
H-I-H---------h
6,6
42 2,4 4-5 65
^ XcPm2151 ^
B>ml570
Df<
XcDm2001
| XdDifa2301 | "\cDm2301_
\cLlm2405_
ArDm2502
XdDra2500
PffrynjAf"'1" < > < >
Рис. 9.16. Карта рестрикции участка Х-хромосомы Drosophila melanogaster,
полученная при анализе перекрывающихся фрагментов ДНК клонированных в
харон-фагах X и отобранных методом "прогулки по хромосоме" слева направо,
как это описано в тексте. На рисунке представ-
лена карта участка протяженностью около 100 000 н.п. Серыми полосами
изображены концевые точки некоторых из хромосомных перестроек; ширина
полос соответствует точности, с которой локализованы концевые точки
перестроек на рестрикционной карте.
9. Методы работы с ДНК
285
Рестрикация и электрофорез в агарозном геле
Окраска геля
>
Фотографирование
Гель помешают на влажную фильтровальную бумагу (между ^ двумя
пластиковыми прокладками)
Нейтрализация (промывка геля в 1М трис, pH 5,5, 2MNaCl)
Денатурация фрагментов ДНК . (промывка геля в спирте, 0,5 М NaOH; 1,5 М
NaCl)
На гель накладывают нитроцеллюлозную пленку сверху помещают
фильтровальную'бумагу и прижимают грузом
Буфер поднимается по фильтровальной бумаге, перенося фрагменты ДНК ДНК
химически связывается с нитроцеллюлозой при выдерживании при температуре
80° С в течение двух часов. После этого нитроцеллюлозный фильтр готов к
гибридизации с радиоактивным зондом
Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК обрабатывают рестриктазами и
образовавшиеся фрагменты подвергают электрофорезу в агарозном геле.
Размеры рестрикционных фрагментов определяют по фотографиям геля,
окрашенного бромистым этидием. Затем фрагменты денатурируют и переносят
на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги. Фрагменты
ДНК
ковалентно связываются с пленкой, после чего пленку обрабатывают
радиоактивным зондом и подвергают радиоавтографии. Сравнение
радиоавтографа с фотографией окрашенного после электрофореза геля
позволяет определить рестрикты, комплементарные радиоактивному зонду.
[Rodriguez R. L., Tait R. С., University of California, Davis.]
участок ДНК вокруг полосы ЗС11-12, так что анализируется лишь ДНК из
хромосомы Df( 1 )dm15elg.) Сравним теперь те же фрагменты, используя в
качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы клона XcDm 1570, который
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed