Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 1." -> 107

Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. Том 1. — М.: Мир, 1987. — 295 c.
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetika1987.djvu
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

накопить достаточно большое количество клонируемых фрагментов ДНК, эта
коллекция будет включать по меньшей мере по одному экземпляру каждой
последовательности генома. Такую коллекцию клонируемых фрагментов
называют библиотекой генома или банком генов.
Если клонируют фрагменты генома Drosophila melanogaster средней длины 15-
20-103 н. п., то для того, чтобы в коллекции были представлены все
участки генома, достаточно около 40000 независимых клонов (общая длина
генома составляет около 1,5-108 н.п.). Для полной библиотеки генома
человека требуется около 800000 клонов (см. дополнение 9.2). В библиотеке
генов содержится вся наследственная информация организма. Однако
определение того, какой именно из томов библиотеки (т. е. клонов)
содержит необходимую в каждом конкретном случае информацию, представляет
очень сложную для генетиков проблему. Если копия соответствующей
генетической информации оказывается доступной в форме структуры молекулы
РНК или в форме последовательности аминокислот, то это может быть
использовано при отыскивании в библиотеке клона, содержащего требуемую
информацию.
Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов к высевают
на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было приблизительно 10000
негативных колоний. Например, библиотека генома Drosophila melanogaster
умещается всего на четырех таких чашках. Каждая негативная колония
содержит химерные инфекционные фаги и большое количество химерных молекул
фаговой ДНК, не уместившихся в головки фагов. Эта свободная ДНК дает
возможность определить, какие именно из негативных колоний содержат
интересующие нас
19-1215
Организация и передача генетического материала
А Б
...
• •
Рис. 9.15. Поиск в библиотеке генома тутового шелкопряда генов оболочки
яйца. На рисунках (А) и (Б) представлены две пленки, снятые с одной и той
же чашки Петри, содержащей 5000 негативных колоний. Обе пленки
выдерживали некоторое время с меченной Р32 кДНК, полученной с помощью
обратной транскрипции из мРНК, выделенной из развивающихся ооцитов. Затем
с пленок смывали остаток не вступившего в гибридизацию зонда, и
подвергали радиоавтографии. Черные пятнышки соответствуют негативным
колониям, в которые включился радиоактивный зонд. Сравнение пятнышек на
двух экземплярах пленки позволяет отличить случайные "позитивы",
проявившиеся лишь на одной из двух пленок, от истинных, проявившихся на
обеих.
фрагменты ДНК. К поверхности чашки Петри прикладывают специальную пленку,
на которой отпечатываются все негативные колонии. Затем пленку снимают и
помещают в раствор щелочи, денатурирующий ДНК. Пленку высушивают и
выдерживают в вакууме при температуре 80°С, что приводит к установлению
ковалентных связей между отпечатанными одноцепочечными молекулами ДНК и
пленкой.
На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так
называемый зонд, т. е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты,
комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную
метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК,
выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует
интересующий нас ген; это может быть также искусственный
дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной
последовательности аминокислот в том белке, который кодируется
разыскиваемым нами геном; наконец, это может быть рестрикт из другого
участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с
комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не
вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию,
позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на
поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие
ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из
соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий
интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК.
Труднее выделить из библиотеки клоны, соответствующие генам с известным
фенотипическим проявлением, но неизвестным непосред-
9. Методы работы с ДНК
283
ственно биохимическим продуктом функционирования. Метод, с помощью
которого эту задачу можно решить, был впервые предложен применительно к
геному дрозофилы Бендером и Хогнессом и получил название "прогулки по
хромосоме". Этот метод требует, чтобы, во-первых, была заранее известна
локализация интересующего нас гена на генетической карте политенной
хромосомы (см. главу 5, например, рис. 5.19) и, во-вторых, чтобы для
какого-нибудь гена той же хромосомы существовал зонд.
Рассмотрим в качестве примера участок Х-хромосомы, изображенный на рис.
5.19, и будем двигаться по хромосоме, как это изображено на рис. 9.16.
Наша цель состоит в том, чтобы отыскать в библиотеке клонируемые
фрагменты ДНК, отвечающие гену dunce, локализованному в хромомере 3D4.
Этот ген необходим для формирования нормальной памяти у мух; при этом он
также кодирует фермент сАМР-специфическую фосфодиэстеразу. Прогулка по
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed