Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
основаниями концы фрагментов соединяются ковалентными связями под
действием лигазы.
Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании
химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например,
плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную
клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация
такого репликона будет приводить к размножению также второго фрагмента,
составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при
этом вектором для другого фрагмента ДНК.
В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векторов)
любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг X и множество различных
плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е.
coli после того, как клетка обработана ионами Са + +. Такая процедура
позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты
чужеродной ДНК (клоны), и размно-
9. Методы работы с ДНК
211
жать ДНК этих клонов в больших количествах. Совокупность методов,
объединяемых названиями "клонирование", или "генная инженерия", произвели
революцию в генетике, биохимии и биотехнологии. В настоящее время ДНК
эукариотических организмов может изучаться на уровне последовательности
нуклеотидов с той же детальностью, которая еще недавно была возможна лишь
в отношении ДНК вирусов. Методы генной инженерии позволяют использовать
Е. coli в качестве фабрик для производства продуктов функционирования
генов человека, например, для производства инсулина и гормона роста.
Вероятно, в недалеком будущем это даст возможность успешно и недорого
лечить диабет, возникающий при недостатке инсулина в организме, и
карликовость, являющуюся следствием недостатка гормона роста. Методы
рекомбинантных ДНК открывают широкие перспективы в решении проблем
медицины, сельского хозяйства и химической технологии. Эти методы обещают
возникновение новой индустрии, называемой биотехнологией, привлекающей в
настоящее время внимание средств массовой информации и финансирующих
организаций.
Векторы для клонирования ДНК
Методы клонирования чужеродной ДНК в клетках Е. coli удобно
проиллюстрировать на примере плазмиды pBR322, специально
сконструированной Франциско Болваром и Раймондом Родригесом для
клонирования маленьких фрагментов ДНК, состоящих всего из нескольких
тысяч пар оснований или еще меньше. Эта плазмида невелика (4362
нуклеотидные пары), несет гены антибиотикоустойчивости атр и tet и в
каждой бактериальной клетке может присутствовать во множестве копий.
Последовательность нуклеотидов плазмиды известна. Ее физическая карта
представлена на рис. 9.11. Обратите внимание на то, что имеется один сайт
для рестриктазы Pst I в гене атр и по одному сайту для рестриктаз Ват HI
и Sal I в гене tet. Наличие этих сайтов именно
Рис. 9.11. Физическая карта клонирующей плазмиды pBR322. Эта плазмида
сконструирована из трех частей. Участок начала репликации (оп')-из
плазмиды рМВ1; ген tet-из плазмиды pSClOl, а ген атр-из транспозона ТпЗ.
Указаны соответствующие уникальные сайты рестрикции.
278
Организация и передача генетического материала
Чашка с тетрациклином
Рис. 9.12. Интеграция чужеродной ДНК в плазмиду pBR322 и отбор клона-
носителя ДНК. Вставка чужеродной ДНК в сайт Ват HI локализованный внутри
гена tet, инактивирует этот ген. Клетки с реком-
Трансформация клеток coli плазмидами, восстановившими кольцевую форму
TetsAmpR- Клоны несут Чашка чужеродную ДНК
с ампициллином бинантнсп^ плазмидой будут обладать фенотипом Tet Amp , а
клетки с плазмидой pBR322, восстановившей свою прежнюю структуру -
фенотипом TetR AmpR.
в генах устойчивости к двум антибиотикам дает возможность отбирать
плазмиды, несущие чужеродную ДНК (рис. 9.12).
Плазмиду рестрицируют Ват HI и образовавшиеся линейные молекулы смешивают
с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой
рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут
соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы
возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК
плазмиды могут соединиться друг с другом: при этом восстановится исходная
кольцевая плазмида с ин-тактным геном tet. Возможно, однако (именно это и
требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в
кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК; при этом
целостность гена tet нарушится. Полученной in vitro смесью молекул ДНК
трансформируют клетки Е. coli, предварительно обработанные ио-
9. Методы работы с ДНК
219
Рис. 9.13. Синтетические фрагменты ДНК, содержащие сайты рестрикции,
можно использовать в качестве связующих звеньев (линкеров) при создании
рекомбинантных молекул. А. Любой фрагмент ДНК без липких концов можно
клонировать при использовании двухцепочечных линкеров. Б. Структура трех
линкеров.
Линкер
ДНК Лигаза >
Рестриктаза
-> чнипшииц
Eco R1
С С С\А А Т Т С G G
