Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.
Скачать (прямая ссылка):
время, достаточное для того, чтобы во всех чувствительных сайтах
произошло расщепление нуклеотидной последовательности. Образовавшуюся
смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. Полосы
идентифицировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля
бромистым этидием. Стартовые точки обозначены жирными стрелками.
Интактная ДНК фага X представляет собой линейную молекулу длиной около 48
500 н. п. При действии рестриктазы Bglll возникают фрагменты длиной
22800,
13600, 9800, 2300 н.п.
(они отмечены тонкими стрелками) и 460 н. п. (неразличим).
Контроль Ava I Ava II Eco RI Hin dill Нра I Bgl II
Геном фага фХ 174 принадлежит к числу самых мелких и наиболее хорошо
изученных (см. гл. 7), и именно для этого генома в 1978 году была
полностью определена последовательность нуклеотидов с помощью описанного
выше подхода (см. гл. 12).
Фаг X также представляет собой хороший пример того, как можно
использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для
описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и
размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных
рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов,
образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с
помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении
карты сайтов рестрикции генома фага X. На рис. 9.7 схематически
изображена карта сайтов Eco RI и Hin dill на фоне генетической и
физической карт генома фага X.
Последовательность образующихся при рестрикции фрагментов в ин-тактной
молекуле ДНК можно установить несколькими способами. Прежде всего можно
использовать неполное расщепление ДНК эндонуклеазами V, последующее
разделение фрагментов электрофорезом. Затем
272
Организация и передача генетического материала
Рис. 9.7. А. Физическая А карта ДНК фага X, на которой указаны сайты
рестрикции для Eco RI и Hin dill. Б. Размеры фрагментов, образующихся при
действии (1) Hin dill; (2) Eco RI и (3) Hin dill и Eco RI. [Murray K.,
Murray N. (1975). J. Mol. Biol., 98, 551.]
A Eco RI сайты I г ? с ? в' 1 D' f F
А |m q\p k 1 h G л| i H 1
A Hin dill сайты ^4 М?1 в нь C | D
12 3 45 6
Л } att red oL Pl'1 Q
10
20
T
30
^---г
40
SO
60
70
T
80
T
90
Электрофорез
А В С 0
(1) I II I
(2)
(3)
A'B'C'D'E' F
N \// /
A
и i i
/} k I
E F
I I
II I I
Fm n p
11 i
q r G
выделенные из электрофоретического геля крупные фрагменты снова
подвергают действию того же фермента и посредством электрофореза
устанавливают идентичность образующихся мелких фрагментов. С другой
стороны, фрагменты, возникшие в результате полного расщепления под
действием одного фермента, можно извлечь из геля, обработать второй
рестриктазой и определить затем с помощью электрофореза размеры
образовавшихся мелких фрагментов. Так, например, из рис. 9.7 видно, что
выделение фрагмента А под действием рестриктазы Hin dill и последующая
обработка Eco RI приводят к образованию фрагментов А' и т, возникающих и
при одновременном воздействии обоими ферментами.
Сопоставление карты рестрикции с генетической картой можно осуществить,
действуя рестриктазами на ДНК, выделенную из различных мутантов фага X с
известными делециями и перестройками в геноме. Сравнивая фрагменты ДНК
фагов дикого типа и мутантных, можно определять участки генетической
карты фага X, в которой локализованы соответствующие фрагменты.
Построение рестрикционной карты генома дает возможность разработать
стратегию определения последовательности нуклеотидов в генах,
представляющих особый интерес. В результате действия нескольких различных
ферментов образуются сравнительно мелкие перекрывающиеся фрагменты,
содержащие не более нескольких сотен нуклеотидов. Эти фрагменты могут
быть выделены в чистом виде, и в них может быть установлена
последовательность нуклеотидов. Затем, зная взаимно перекрывающиеся
участки последовательностей, можно восстановить последовательность
нуклеотидов в крупных фрагментах и в геноме в целом.
Методы работы с ДНК 273
Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование)
Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано
несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции используются
для фиксации специфических "точек отсчета". Последовательность
нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200
нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких
фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании
комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности
нуклеотидов в первой цепи.
Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на
создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в
определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как
размеры фрагментов могут быть различны. Каждый такой исходный набор
фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофореза в
