Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Айала Ф. -> "Современная генетика. Том 1." -> 102

Современная генетика. Том 1. - Айала Ф.

Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. Том 1. — М.: Мир, 1987. — 295 c.
Скачать (прямая ссылка): sovremennayagenetika1987.djvu
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 113 >> Следующая

Asm I G | GNCC
Avail G | G(A/T)CC
Eco RII | CC(A/T)GG
Hin II G | ANTC
9. Методы работы с ДНК
269
Продолжение табл. 9.2.
Фермент Сайт узнавания
Симметричный (N = 4)
Alu I AG|CT
Fnu DII CG|CG
Нае III GG|CC
Hha 1 GCG|C
Нра II C|CGG
Mbo I |GATC
Тещ I Симметричный метилированный (N = 4),t T|CGA
Dpn I GmATC
Msp I C(mC/C)GG
Type III
Ассиметричный (N = 5)
Hga I GACGCNNNNN|(3') CTGCGNNNNNNNNNN| (5')
Hph I GGTGANNNNNNNN| (3') CCACTNNNNNNN|(5')
Mbo II GAAGANNNNNNNN|(3') CT T CT NNNNNNN|(5')
1 Для ферментов типа II последовательность представлена лишь в одной
цепи; комплементарную последовательность можно достроить. Вертикальная
линия обозначает положение, в котором разрываются фосфодиэфирные связи.
Звездочки указывают основания, которые могут быть метилированы
соответствующими ферментами модификации. 2 Специфический сайт узнавания
Dpn I содержит метилированный аденин (тА), тогда как сайт Mbo I содержит
неметилированное основание. Msp I узнает указанную последовательность
независимо от метилированное(tm) внутреннего С; Нра II, напротив, узнает ту
же последовательность лишь в том случае, если внутренний С не
металирован.
ками, точка разреза двойной спирали может совпадать с осью симметрии, а
может быть сдвинута относительно нее. В последнем случае образуются
комплементарные концы, и между соответствующими основаниями могут сперва
устанавливаться водородные связи, а затем посредством ДНК-лигазы
происходить сшивка фрагментов с возникновением ковалентных связей между
соседними нуклеотидами. Защита от повторного расщепления рестриктазой
обеспечивается ферментами модификации, метилирую-
Организация и передача генетического материам
щими некоторые основания в сайте узнавания: соответствующие основания
помечены звездочкой. Метилирование происходит после того, как
соответствующий нуклеотид включается в ДНК в процессе репликации. Эти
ферменты могут действовать либо на неметилированные, либо на по-
луметилированные сайты; при этом в процессе полуконсервативной репликации
образуются полностью метилированные сайты.
Из различных видов и штаммов бактерий выделено и очищено более 175
различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено
более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной
спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых
из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия
чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов
бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они,
по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК in vivo.
Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни
было, рестриктазы независимо от их функций in vivo служат мощным
инструментом структурного анализа геномов.
Рестрикционный анализ молекул ДНК
Огромные возможности рестриктаз можно проиллюстрировать на следующем
примере. Рассмотрим двухцепочечную репликативную форму бактериофага
фХ174. Он содержит два ковалентно связанных комплементарных кольца, из
5386 нуклеотидов каждое. Чистый препарат ДНК состоит из гомогенных
молекул фага. Теперь представим себе, что этот препарат подвергается
действию эндонуклеазы, однократно разрезающей двойную спираль кольца без
какой-либо специфичности в отношении точки разреза. В результате мы
получим препарат ДНК, содержащий линейные молекулы 5386 различных типов,
т. е. препарат, совершенно бесполезный с точки зрения анализа
нуклеотидных последовательностей. Напротив, если при этом используется
рестриктаза Pst I, разрезающая па-линдромную последовательность GTGCAG
(выписана последовательность нуклеотидов лишь в одной цепи двойной
спирали), то получается гомогенный препарат линейных молекул ДНК длиной
до 5386 нуклеотидов каждая, упорядоченных в одной и той же
последовательности. Геном фХ174 содержит лишь один сайт, узнаваемый
рестриктазой Psfl.
В геноме фХ174 есть сайты, узнаваемые многими другими ферментами,
перечисленными в табл. 9.1. Количество и локализация сайтов для каждой
рестриктазы строго определены. Таким образом, воздействие каким-то
ферментом приводит к образованию уже известного количества фрагментов ДНК
фиксированного размера. Размер каждого типа фрагментов можно узнать с
помощью электрофореза в геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле
быстрее крупных. Так как фрагменты каждого типа характеризуются
одинаковым размером и одинаковой последовательностью нуклеотидов, то
нуклеотидную последовательность в каждом из них можно определять
отдельно, на выделенном посредством электрофореза в геле препарате.
Полную последовательность нуклеотидов в геноме можно затем "собрать" из
последовательностей отдельных фрагментов, если знать последовательность
самих фрагментов в геноме.
9. Методы работы с ДНК
271
Рис. 9.6. Электрофоретический анализ ре- - стрикционных фрагментов ДНК.
ДНК фага X инкубировали с различными указанными на рисунке рестрикта-зами
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed