Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
1111111111111111 ГТТГТПТГТ'Н
Эндонуклеазы и (необязательно) экзонуклеазы
_______________________тгпптг
.............1ГТПI ТТЛ'ТТЛ пп
11Г|'ПIITIГГГ111111II111111
и
1111) ITT
Полимераза, лигаза
п 11111 гтп I гп 11111 m I itti 11111 ithtt.............11 iti 1111 m 1111 llli шгшз
Область молекулярной
гетерозиготы
Рис. 30. Схема молекулярного механизма рекомбинации фрагментов, претер-
певших разрыв в несовпадающих местах.
/ и // — ДИК первого и второго скрещиваемых организмов соответственно.
В литературе накопилось также немало данных и о том, что протекание процессов синтеза ДНК является непременным условием рекомбинации. Подавление их ядами репликации останавливает и рекомбинацию. Это подтверждает обязательность тех этапов схемы на рис. 30, которые связаны с репаративным синтезом.
Следует обратить особое внимание на общность ряда механизмов рекомбинации и репарации. Простейшие вирусы типа РНК-фагов могут использовать для этого часть энзимов репарации заражаемой клетки (полимераза может быть собственной), а сложноорганизованные ДНК-вирусы могут индуцировать синтез собственных нуклеаз, лигаз и ДНК-полимераз.
Достоинства представленной модели очевидны. Она позволяет объяснить многочисленные указания на необходимость синтеза ДНК при рекомбинации, не содержит требований разрыва цепей разных хромосом в строго совпадающем месте, объясняет наличие участка молекулярной гетерозиготы и, наконец, предполагает использование при рекомбинации тех же энзимов, которые необходимы для репаративных процессов. Однако она имеет и существенный недочет. Вероятность близких друг к другу разрывов на обеих цепях обеих рекомбинирующих ДНК будет достаточно большой лишь при условии, что вообще разрывы возникают в норме очень часто. Пока трудно объективно оценить частоту разрывов, но понятно внимание, которое привлекают гипотезы, не требующие на начальных стадиях процесса разрывов по обеим цепям каждой из ДНК. Кроме того, полученные в последнее время электронномикроскопические картины рекомбинирующих ДНК содержат элементы необъяснимые, если ограничиться изложенной выше схемой. Наиболее обоснованными представляются гипотезы Broker, Lehman (1971), а также Sobell (1972). Здесь нет необходимости излагать их во всех деталях, отметим лишь наиболее существенные моменты. Гипотезы эти не требуют на первой стадии процесса разрывов по обеим цепям каждой из ДНК. Они полагают, что если разрывы произошли в близких точках хотя бы по одной из цепей в каждой из ДНК, то возможно соединение комплементарных участков неповрежденных цепей — так, как это показано на рис. 31 (а, б). Далее зона контакта может изменяться по протяженности. Нуклеазы отсекают часть ветвей (г), а часть разрывов ликвидируется лигазами (д). Брешь на одной из цепей, возникающая за счет неточного Совпадения мест разрывов, заполняется репаративным синтезом (г). Гипотеза подтверждается электронномикроскопическими наблюдениями. На рис. 32 приведены снимки, демонстрирующие как бы «слипшиеся» на небольшом протяжении молекулы фаговой ДНК. Такие картины наблюдаются нередко, причем частота их коррелирует с интенсивностью рекомбинации. Особенно интересен вариант, представленный на рис. 32,6. Там участок соединения двух молекул завершается небольшим отростком, что хорошо соответствует схеме на предыдущем рисунке. Еще более жестким является механизм, обуславливающий начало рекомбинации в строго определенных точках по гипотезе Sobell. Последняя включает ряд элементов предшествующей гипотезы Broker и Lehman. Однако Sobell предполагает, что разрывы и первичные соединения рекомбинирующих молекул ДНК возникают преимущественно в регуляторных участках, где, по Gierer и Crick (см, гл. VI, рис. 38), существуют сим-
метричные петлевые структуры, поддерживаемые белками типа Lac- или Я-репрессоров. Sobell допускает также образование петлевых структур (см.рис.31),способных мигрировать вдоль рекомбинирующих ДНК.
Гипотеза Sobell особенно привлекательна для объяснения многих данных о неодинаковой вероятности первичного перекреста в разных точках рекомбинирующих хромосом высших организмов. Правда, и без этой гипотезы очевидна неравноценность для
а б
Рис. 31. Схема молекулярного механизма рекомбинации по Broker и Lehman (1971)—стадии а — д и фрагмент механизма, предполагаемого Sobell
(1972),— стадии дг — е'.
рекомбинации разных областей хромосом. Можно с уверенностью считать, что различные участки ДНК обладают неодинаковой прочностью и устойчивостью к нуклеазам. Эти различия, например у вирусов, усиливаются тем, что не все участки ДНК связаны с белками, да и белки эти нередко гетерогенны. Следовательно, даже на уровне вирусных хромосом разрывы неравновероятны. Показано, что ДНК Т-четных фагов вскоре после проникновения в заражаемую клетку распадается на 4—8 фрагментов весом в 15—30 • 106 дальтон. Именно на основе этих фрагментов разыгрывается ряд последующих процессов развития фага. Они же могут быть материалом для предпочтительных рекомбинаций между локусами, расположенными во внутренних областях этих фрагментов. Аналогичная ситуация возможна и при последующих разрывах. Это подтверждается неодинаковой частотой рекомбинаций по равноудаленным локусам, показанной рядом генетических работ с фагами и прямыми радиоаутографическими на-
