Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 28. Схемы рекомбинаций с помощью механизмов выборочного копирования (а) и перекрестного соединения ДНК, претерпевших координированный разрыв в одном и том же месте по обеим цепям (б).
А, В и А', В' — рекомбинируемые фрагменты хромосомы.
Дикий штамм
С
mi
Мутантный штамм
с+
mi
+
Рекомбинант Cmi +
Рекомбинант Сmi
+
mi
+
mi
0,85
0,15-
1.0
Рис, 29. Схема, поясняющая соотношения фрагментов хромосом в рекомбинантах Cmt+ и С+ mi в опытах Meselson и Weigl (см. текст).
шей, так как заражаемые клетки кишечной палочки выращивались на среде с обычным азотом и углеродом, и в процессе редупликации должно происходить обогащение легкими компонентами. Здесь уместно также отметить, что хотя слои с указанной плотностью содержат повышенную концентрацию рекомбинантов Ст?+ и C+mt, последние встречаются и в других слоях (особенно в наименьшем по плотности) вследствие процессов рекомбинации уже редуплицировавшихся ДНК, повторных актов рекомбинации в разных точках и т. п. Они, однако, не мешают регистрации упомянутого пика. Meselson и Weigl осуществили и другие варианты опытов, построенных по такому же принципу, исключив опасность ложных заключений. Прямые наблюдения электронномикроскопических радиоавтографов ДНК из рекомбинантов фага Т-1, полученных в присутствии ингибитора редупликации — 5-фторде-зоксиуридина, также свидетельствуют о фрагментации и последующем перекрестном воссоединении отрезков (С. Е. Бреслер и сотр., 1972). Все эти, а также подобные эксперименты других авторов, позволили отвергнуть предположение о необходимости
редупликации всей хромосомы для образования рекомбинанта, а следовательно, отвергнуть и механизм выборочного копирования.
Гипотезе о выборочном копировании противоречат и указания об увеличении числа рекомбинаций при одновременном воздействии мутагенами, вызывающими разрывы в нитях ДНК (излучениями, например). Механизм этого эффекта очевиден, если исходить из 2-й или 3-й схемы рекомбинации, и трудно объясним с точки зрения 1-й схемы. Заметим, что явление это может быть полезно тогда, когда необходимо повышение интенсивности рекомбинации в эксперименте.
Все изложенные выше данные позволяют отклонить механизм выборочного копирования, но не позволяют сделать выбор между механизмами с совпадающими и несовпадающими местами разрыва цепей. На рис. 30 представлена одна из простейших гипотетических схем последнего. Как видно, процесс начинается либо с разрывов одиночных цепей под действием эндонуклеаз в разных точках, либо с разрывов сразу двойной цепи и неравномерного «состригания» экзонуклеазами концов одиночных цепей. Далее происходит перекрестное соединение комплементарных участков концов цепей из фрагментов разных хромосом. Бреши в цепях образовавшейся новой хромосомы заполняются благодаря репликации и действию лигаз. В результате гибридная хромосома имеет небольшой участок так называемой молекулярной гетерозиготы, где нити происходят от разных партнеров, и обширные гомозиготные области, где либо обе нити происходят от одного из партнеров, либо одна образована репликативным синтезом на другой. Рассматривая схему, можно убедиться, что важнейшими аргументами за ее правильность были бы: во-первых, демонстрации существования в рекомбинантах гетерозиготных участков, которые исчезают при последующем их размножении, и, во-вторых, доказательства обязательности синтеза ДНК при рекомбинации. В ряде работ по скрещиванию бактериофагов с хорошо картированными хромосомами было показано, что многие вирионы в первом поколении действительно обладают гетерозиготной областью (Г. Стент, 1965). Размеры ее варьируют, но часто достигают 500, а нередко даже нескольких тысяч нуклеотидных остатков. Иначе говоря, такая область может «вместить» несколько близко расположенных цистронов. Тестом на наличие гетерозиготной области является объединение двух разных цистронов (меченных мутациями у каждого из взаимодействующих партнеров) на период существования начальной формы рекомбинанта и далее их расхождение в последующих поколениях. При этом признаки, связанные с другими цистронами, не входящими в гетерозиготный участок, остаются рекомбинированными. Примером может служить образование «крапчатых» стерильных пятен в первой генерации и исчезновение их в последующих генерациях при скрещивании дикого фага Т4 с его мутантом. Дикий штамм характеризуется меньшей скоростью лизиса бактерий, чем мутантный, и дает не-
гативные колонии со «смазанными» границами зоны просветления. «Крапчатость» просветления в колонии свидетельствует о том, что из одного начального рекомбинанта, заключавшего в /--области хромосомы генетический материал обоих партнеров, образовалась затем смешанная популяция, где вновь произошло разделение по этому признаку.
ПНИ'........Г...............................III111111111 п ппттттп 1-п-пт
Н
Эндонуклеазы и(необязательно)экзонуклеэзы
TTI11111 Г'П IГТ'111'ТТТIT11
П 111 И 11111ГТ111 Г1Т1П ИТ11111111 П 11111 П II11111111II .......тимптп
