Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Элонгация заканчивается, когда в Асп-центр * входит один из кодонов мРНК, являющихся сигналом для завершения синтеза,— УАА, УАГ или У ГА. Начинается стадия терминации.
Сигналы терминации с мРНК воспринимаются специальными внерибосомными факторами терминации — RF-1 или RF-2. Это белки с молекулярным весом 44—47 000, специализированные на узнавании двух кодонов терминации: первый — УАА и УАГ, второй УАА и У ГА. Соединившись с рибосомой, они вызывают отщепление готового полипептида от последней пептидил-тРНК. Полагают, что эта реакция осуществляется опять-таки с участием трансферазного центра,— пептидил и в этом случае переносится, но не на Аа-тРНК, а «на воду», причем фактор RF-1 или RF-2 служит промежуточным партнером. В то же время факторы RF-1 и RF-2 не оказывают какого-либо влияния на мРНК. В их функции не входит и отщепление от полипептида формильного остатка или формилметионина. Терминация стимулируется также внерибосом-ным белковым фактором RF-3, однако обязательность его сомнительна, и к узнаванию кодонов терминации он отношения не имеет. Терминация трансляции у эукариотов обеспечивает единым внерибосомным белковым фактором.
Отщепление формильного остатка или формилметионина от освободившегося полипептида происходит вне рибосомы под действием узкоспециализированных энзимов.
Превращения комплекса рибосома мРНК-тРНК на этом не заканчиваются. Отщепление деацилированной тРНК и мРНК, по-видимому, происходит после ухода пептидила, так как связь с П-центром нарушается или ослабляется, а связи очередного кодона с Асп-дентром не возникает. Теперь для подготовки рибосом к новой инициации необходимо освобождение ее от мРНК и диссоциация на субъединицы. Эти реакции также не протекают самопроизвольно, Отделение мРНК требует участия двух внерибосом-ных факторов и ГТФ. Один из них — уже знакомый нам фактор транслокации EFG. Участие этого фактора, а также ГТФ, в очередном механо-химическом акте не вызывает удивления. Природа второго внерибосомного фактора отделения мРНК пока не установлена, известна лишь его относительная термостабилыюсть (Hirashima, Kaji, 1972).
Наконец, диссоциация рибосомы на субъединицы требует участия еще одного внерибосомного белкового фактора, уже знакомого по стадии инициации — IF-3. Строго говоря, еще не совсем ясно, диссоциирует ли этот фактор рибосому или предотвращает объединение освободившихся при терминации субчастиц в 705-частицу. Если подтвердится последняя точка зрения, то образование 705-частиц, свободных от мРНК, можно считать тупиковой реакцией, не обязательной при интенсивном синтезе белка (Davis, 1971; Caskey et al., 1972).
До сих пор не выявлен механизм, определяющий, сколько раз мРНК может быть использована для трансляции. Установлено существование рибонуклеазы V, активной лишь в присутствии рибо-сом и, как полагают, предназначенной для разрушения мРНК (Kuwano et al., 1970). Однако остается неясным, почему она атакует мРНК только после многократной трансляции и с чем связаны очень значительные различия в средних сроках существования разных мРНК. Выдвигалась гипотеза (так называемая гипотеза «билетиков»), которая предполагает, что терминальный участок мРНК содержит определенное число повторяющихся не-транслируемых олигонуклеотидных последовательностей, причем в начале или в конце каждого акта трансляции отсекается по одному такому олигонуклеотиду («билетику»). Как только совершается столько актов трансляции, сколько необходимо для отсечения всех нетранслируемых нуклеотидов, нуклеаза «добирается» до иннциаторного кодона, повреждает его и исключает таким образом мРНК из дальнейшего использования (Sussman, 1970). Гипотеза находится в хорошем соответствии с фактическими данными о наличии у З'-конца мРНК больших полиадениловых блоков и с отдельными указаниями на корреляцию между сроками жизни мРНК и размерами блоков (Shoeness, Darnell, 1973, и др.).
Многоэтапный цикл функционирования рибосомы осуществляется очень быстро для такой сложной системы. В бесклеточ-ных системах из бактерий скорость роста полипептида достигает 500 аминокислотных остатков в 1 мин. В системах из животных клеток процесс протекает примерно в десять раз медленнее.
Важнейшим критерием правильности изложенных выше представлений о механизмах синтеза белка является создание бескле-точной системы, которая состоит из всех описанных компонентов и обеспечивает синтез полипептида, кодируемого вводимой в систему очищенной мРНК. Вначале эта задача была успешно решена для бактериальных рибосом (Nirenberg, 1964; Dohan et al., 1971, и др.). Достаточно интенсивный синтез белка идет в смесях, содержащих рибосомы кишечной палочки, тРНК и внерибосомные факторы в виде так называемой «S-ЗСЬ-фракцни (супернатант, получаемый центрифугированием разрушенных бактерий при 30 000?),или более очищенные препараты рибосом, тРНК и амино-ацилсинтетазы (последние в виде суммарного препарата — рН5-эи-зима), природные или искусственные мРНК, набор аминокислот, ГТФ, АТФ, глютататион или р-меркаптоэтанол, NH4CI, ацетат магния, а также трисбуфер с pH 7,6 в 0,25 М сахарозе. Особенно эффективной эта система становится, когда обеспечивается регенерация расходуемой АТФ введением фосфоэнолиирувата и пируват-киназы. При использовании природных мРНК особенное значение имеет обеспечение системы оптимальными концентрациями всех внерибосомных белковых факторов трансляции либо за счет суммарных экстрактов, либо в виде индивидуальных препаратов.
