Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
В экспериментах с некоторыми синтетическими РНК, в частности с гомополимером — полиуридиловой кислотой, инициация может протекать и без формилметиониновых кодонов. Если бы не это обстоятельство, то был бы невозможен замечательный эксперимент Nirenberg и Ochoa, впервые наблюдавших процесс трансляции in vitro, направляемый полиуридиловой кислотой. Тем не менее, и у бактерий, и у эукариотов инициация с природными мРНК обязательно требует наличия формилметиониновых кодонов в начале- транслируемой последовательности нуклеотидов.
Следующий фактор инициации — IF-2 (он же F2 и FIII) —белок с молекулярным весом 80—100 000 — тоже стимулирует процесс присоединения мРНК, хотя и не является, по-видимому, абсолютно необходимым для этой реакции. Его основные функции состоят в обеспечении последующих реакций инициации, когда к кодонам АУГ или ГУГ на 305-субчастице присоединяется фор-милметионил-тРНК. На этом этапе образуется так называемый 305-начальный (или 305-инициаторный) комплекс, состоящий из 305-субчастицы, мРНК, фмет-тРНК и IF-2, причем IF-2 является его обязательным компонентом. Ранее полагали, что в этот комплекс входит и ГТФ, однако в последнее время укрепилось представление, что ГТФ является лишь ускорителем образования 305-начального комплекса, причем необязательным (Mazumder,
1972).
Далее следует реакция замещения IF-2 на 505-субчастицу рибосомы. При этом фмет-тРНК сразу оказывается в П-участке. Участие ГТФ, сопровождаемое его гидролизом до ГДФ, представляется обязательным для вытеснения фактора 1F-2. Сам по себе
фактор IF-2 оказался ГТФ-азой, активность которой проявляется лишь в комплексе с рибосомой. В этом отношении он похож на EF-G фактор элонгации. Однако помещение фмет-тРНК в П-уча-сток может происходить без участия ГТФ. Как видно, сколь ни соблазнительно представить стадию инициации как процесс, в основном аналогичный реакциям элонгации, отличий довольно много (Caskey, 1972; Mazumder,T972).
Последние реакции инициации ускоряются также фактором I1M (он же FI, A, FI) —относительно небольшим белком с молекулярным весом 9000.
Теперь рибосома готова к следующей стадии — элонгации. Элонгация начинается с присоединения а м и н о а ци л-тРНК. Ее следует считать первой, ибо формилметионил-тРНК — это не ами-ноацил-тРНК и, кроме того, после завершения синтеза полипептида (а по некоторым данным, еще по ходу элонгации) формилме-тяонин в большинстве случаев отщепляется. Реакция присоединения Аа-тРНК к рибосоме, подготовленной к элонгации (и далее в начале каждого нового цикла элонгации) оказалась весьма сложной и отнюдь не сводится к взаимодействию кодона в Асп-центре с антикодоном. Каждый акт присоединения Аа-тРНК связан в естественных условиях с расщеплением одной молекулы ГТФ, причем этот «расход» не следует смешивать с расщеплением ГТФ, происходящим позже — для транслокации новой пептидил-тРНК. К сожалению, в отличие от стадии транслокации, еще труднее объяснить, для чего именно расходуется столь значительная энергия при связывании каждой Аа-тРНК. Ни кодон-антикодоновое взаимодействие в Асп-центре, ни взаимодействие акцепторного конца Аа-тРНК с Ат-центром П-участка не предполагает a priori необходимости затрат энергии. Последующая же реакция замыкания новой пептидной связи — заведомо обеспечена энергией, аккумулированной в Аа-тРНК еще на стадии синтеза ее из аминоациладени-лата. Возможно, ключом к пониманию роли комплекса EF-T— ГТФ являются данные о том, что он снимает подавляющее действие 505-субчастицы на присоединение Аа-тРНК к Асп-центру 305-субчастицы (Kaufmann, Zamir, 1972). Видимо, «вталкивание» Аа-тРНК между контактными поверхностями субчастиц собранной рибосомы связано с определенными трудностями. Вместе с тем, упоминавшийся выше феномен «неэнзиматической» трансляции без ГТФ заставляет полагать, что эти трудности не связаны с наличием какого-то энергетического барьера.
Кроме ГТФ, реакция требует участия внерибосомного фактора EF-TU (он же Tu, S3 и TIW). Это довольно лабильный белок с молекулярным весом около 42 ООО, активность которого зависит от SH-групп. Он обладает очень высоким сродством к ГТФ. Аа-тРНК предварительно образует с ГТФ и с фактором EF-TU тройственный комплекс и лишь в этом виде взаимодействует с рибосомой. После того как Аа-тРНК занимает там свое место, связываясь с Асп-центром, EF-TW освобождается в виде соединения с образовавшимся ГДФ. Помимо нестабильного фактора EF-TU,
в этом этапе процесса участвует и другой, относительно стабильный фактор EF-TS (он же Te, Sb TIS). Он также является белком, молекулярный вес его— 19 000. EF-TS катализирует замену ГДФ в «отработанном» комплексе EF-TU— ГДФ на ГТФ и, таким образом, ускоряет формирование комплекса с новой Аа-тРНК. В системах трансляции эукариотов аналогом факторов EF-TW и Тв является единый фактор EF-I.
Реакции элонгации, следующие за присоединением Аа-аРНК,— перенос пептидила на Аа-тРНК, транслокация и вытеснение освободившейся тРНК, описаны выше и не требуют дополнительных пояснений. Все реакции элонгации многократно повторяются. Освобождающийся б'-конец мРНК может связываться с новыми рибосомами и еще до того, как будет закончен синтез полипептида на первой рибосоме, начинать и вести синтез следующих молекул того же белка. Присоединение к мРНК все новых и новых рибосом происходит через интервалы примерно в 80 нуклеотидных остатков. Образующийся своеобразный конвейер сборки полипептидов называют полирибосомой, или полисомои. При интенсивном синтезе белка в клетке преобладают именно полисомы. Длина их зависит от размера данной мРНК. При весе мРНК от 0,2 до 2,0* 10е дальтон полисома состоит из десятков рибосом. Для очень больших по размеру мРНК (в частности, в клетках животных) с весом порядка 3—5*10® дальтон описаны гигантские полисомы, состоящие из более чем 100 рибосом каждая. Длина их близка к 1 мк, причем такие полисомы образуют спиральную структуру, содержащую по 4—5 рибосом на один виток.
