Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ашмарин И.П. -> "Молекулярная биология, избранные разделы" -> 50

Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.

Ашмарин И.П. Молекулярная биология, избранные разделы — М.: Медицина, 1974. — 360 c.
Скачать (прямая ссылка): molekulyarnayabiologiya1974.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 164 >> Следующая

из
Часть В
Часть А
Часть С
iiiti I I I t t
-1—3-“)-’
с>Г^
iiiiTi'TiTTTiii iifi
I I I I I I I I I t ( I I I I I I I f
-jz н-?г—?--->--j-> -л--»--—?->-?: - ^->—?—ч_р.
о
о
з:
С
О
-Х-
Полинуклеотидкнказа
J1 и газа
транскриптазы на матрице мРНК был синтезирован цистрон, ко-' дирующий одну из полипептидных цепей кроличьего глобина. При этом был использован ряд обстоятельств, облегчающих выделение индивидуальной мРНК,— относительно высокое содержание ее в клетках, синтезирующих глобин, и наличие с З'-конца большого полиаденилового блока (Ross et al., 1972). Наконец, важнейшим событием является синтез одного из генов, осуществленный в лаборатории Khorana преимущественно химическими методами (Agarwal et al., 1970). Естественно, что для этой цели был избран один из самых «миниатюрных» генов — цистрон, кодирующий дрожжевую транспортную РНКАла, состоящую из 77 нуклеотидов, последовательность расположения которых известна. Такой цистрон в 4—40 раз меньше, чем цистроны, кодирующие структуру большинства белков. Предшествующие работы показали, что возможности химического синтеза полинуклеотидов пока ограничены. Из-за потерь на каждой стадии удается получать с приемлемым выходом не более, чем 20-членные полинуклеотиды. Поэтому Khorana и сотр. вынуждены были прибегнуть к энзиматической сшивке концов полинуклеотидов с помощью полинукле-отидлигазы (колифага Т4). Следовательно, процесс синтеза гена в целом пока еще не является чисто химическим. Более того, чтобы обеспечить действие лигазы необходимо было наличие остатка ортофосфата на одном из сшиваемых концов в 5'-положении. Химическими методами этого трудно пока добиться. Авторы опять-таки воспользовались энзимом — полинуклеотидкиназой колифага Т4, которая фосфорилировала 5'-ОН-группу за счет АТФ. Наконец, известно, что лигаза специализирована преимущественно на сшивании лишь одной из цепей двуцепочечной молекулы ДНК. Вторая цепь должна быть целой. Эта трудность была преодолена следующим образом. Исходные полинуклеотиды синтезировались и попарно сводились с таким расчетом, чтобы после взаимодействия комплементарных областей оставались концевые одноцепочечные участки. Далее, при последующих встречах таких частично биспиральных олигонуклеотидов происходило «слипание» комплементарных концов и образовалась большая биспиральная молекула, в которой каждый разрыв на одной из цепей располагался над целым участком другой цепи. Этот прием и общая последовательность синтеза гена тРНКАла представлены на рис. 13. Как видно, вначале были синтезированы 15 одноцепочечных олигонуклеотидов, содержащих от 5 до 20 оснований. Затем они были объединены в большие по размерам фрагменты — Л, В и С.
Рис. 13. Схема синтеза гена тРНКАла дрожжей (Agarwal et al., 1970).
Одноцепочечные олигонуклеотиды, синтезированные предварительно химическими методами, пронумерованы. Каждая из частей (А, В и С) формировалась вначале из олигонуклеотидов за счет взаимодействия комплементарных участков цепей, а затем в точках, обозначенных стрелками, производилась продольная ковалентная сшивка с помощью лигазы (после предварительного фосфорилнровання 5'-ОИ-групп полинуклеотидкиназой). В заключение частиЛ, В и С последовательно соединялись за счет комплементарности концевых фрагментов, оставшихся одноцепочечными, и сшивались лигазами в точках, обозначенных полыми
стрелками.
В свою очередь эти последние были соединены с помощью тех же приемов в целую молекулу гена.
Таким образом, оперируя в качестве исходных продуктов производными четырех дезоксимононуклеотидов и нуклеозидов, аде-нозинтрифосфатом, двумя энзимами колифага Т4 — полинукле-отидлигазой и полинуклеотидкиназой, а также рядом подсобных реагентов, необходимых для химического синтеза и создания необходимых условий для энзиматических реакций, Khorana и сотр. смогли воссоздать целый ген. По предварительным данным, такой ген может редуплицироваться с помощью ДНК-полимеразы и считываться с образованием «полуфабриката» тРНКАла (именно «полуфабриката», ибо для образования самой тРНКАла необходимы еще реакции превращения части оснований в минорные, происходящие in vivo уже после завершения транскрипции гена, и некоторые другие процессы).
Высоко оценивая значимость всех этих достижений для решения ряда теоретических проблем молекулярной биологии, следует в то же время предостеречь от поспешных заключений о наличии достаточно широких возможностей синтеза различных генов, оперонов и т. п. Пока задача решена лишь для простейших случаев, причем с такими затратами сил и средств, что органико-химический синтез более сложных генов представляется делом относительно далекого будущего даже с учетом все убыстряющегося раз^ вития этой области знания. Тем более не оправданы популярные заявления о ближайших прикладных аспектах этих работ, хотя в будущем огромные практические их следствия не вызывают сомнений.
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed