Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Большой интерес представляют данные Qasba и Aposhian (1971) об использовании так называемых псевдовирионов для введения генетического материала в ядра клеток высших организмов. Они установили, что в популяции вируса полиомы имеется небольшая доля частиц, которые представляют собой фрагмент ДНК хозяина, заключенный в белковую оболочку вириона. Уже через 24 ч после заражения другой клетки эту ДНК можно обна-
ружить в ядре. Пока, однако, нет прямых доказательств ее внедрения в геном заражаемой клетки.
Успешными оказались довольно дерзкие попытки Merril и сотр.
(1971) использовать бактериальный вирус — колифаг Я,—для введения генов бактерий в геном клеток животных. В качестве реципиентов они использовали фибробласты из кожи людей, страдающих врожденной неспособностью продуцировать р?)-галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу (ГФУТ),—энзим, ген которого входит в галакто’зный оперон кишечной палочки. А,-фаг, как уже указывалось выше, способен временно включить в свой геном gaZ-оперон. Контакт фага к, несущего gaJ-оперон, или даже его ДНК без других компонентов вириона, с фибробластами привел к приобретению последними ГФУТ-активности, сохранявшейся, по крайней мере, в течение 8 генераций.
Особенное внимание привлекают перспективы рекомбинации строго определенных участков генома, которая производилась бы биохимическими методами. Такая принципиально новая возможность намечается в результате исследований последних нескольких лет. Чтобы оценить ее, сопоставим вновь направленность, «при-цельность» разных способов изменения генома. Наименее направленными являются, очевидно, мутагенные воздействия. Из различных форм переноса генетических нуклеиновых кислот (трансформация, трансдукция, перенос эписом, сексдукция, рекомбинация) наиболее специфичными следует считать перенос эписом и такие формы переноса фрагментов хромосомы хозяина умеренными фагами, когда прикрепление последнего идет к строго определенному участку хромосом, т. е. специфическую трансдукцию. При наличии большого набора соответствующих фагов и обстоятельно картированной хромосомы бактерии возможно очень точное встраивание этим методом тех или иных генов в различные участки хромосомы. Что касается сексдукции с переносом части хромосомы, то она хорошо регулируется лишь в отношении определения доли переносимой хромосомы. Однако последующая рекомбинация малоуправляема. Новые возможности связаны с открытием, во-первых, лигаз, ковалентно сшивающих фрагменты ДНК, и, во-вторых, с выявлением таких участков ДНК, по которым происходит преимущественное дробление при некоторых воздействиях. Это позволяет надеяться на получение in vitro вирусных ДНК, состоящих из предварительно отобранных и «сшитых» лигазой генов, способных обеспечить образование жизнеспособных вирионов с заданными свойствами. Разумеется, первыми объектами таких экспериментов должны стать наиболее просто устроенные ДНК-вирусы, содержащие 7—20 генов (например, колифаг <рХ174, вирус полиомы), или те из сложных ДНК-вирусов, геном которых обстоятельно картирован (например, А.-фаг). В то же время в начальной фазе таких исследований приходится предполагать значительные трудности, обусловленные тем, что далеко не всякие сочетания генов из разных штаммов, а тем более видов, могут дать жизнеспособные вирионы. Одним из самых интересных
исследований в этом направлении представляется работа Jackson и сотр. (1972), которые смогли биохимическими методами объединить в одну молекулу ДНК вируса хомяка (SV-40) и ДНК фага лямбда. К тому же последняя содержала gaZ-оперон кишечной палочки, присоединенный in vivo при предшествующем культивировании. Важным элементом метода, использованного авторами, явилось присоединение к концам Одной из соединяемых хромосом одноцепочечных олигонуклеотидов пол и-Л, а к другой — поли-7\ В результате концы разных хромосом «слипались» за счет образования биспиральных поли (Л. Т.). Далее, бреши застраивались с помощью. ДНК-полимеразы и лигазы. Корректность метода была проверена путем разрезания и соединения в пределах хромосомы одного и того же вируса — получалась биологически активная ДНК. Свойства же описанной выше ДНК-«монстра», содержащей хромосомы столь далеко стоящих друг от друга вирусов, сейчас интенсивно исследуются.
Особое значение для такого рода генетической биоинженерии имеют методы выделения индивидуальных генов, оперонов и т. п. По-видимому, один из наиболее перспективных путей состоит в выделении индивидуальных мРНК из полисом иммунологическими методами (опираясь на иммунные свойства синтезируемого полисомой белка) с последующим синтезом ДНК-копии при помощи обратных транскриптаз—так, как это описано в главе III. Последние могут оказаться также незаменимыми в опытах по соединению фрагментов хромосом РНК-содержащих вирусов, так как пока не найдены Р1. ч-лигазы, без которых ковалентное соединение таких фрагментов невозможно. Вероятно, с помощью обратных транскриптаз можно будет получать биспиральные ДНК-экви-валенты вирусных РНК и производить «вырезание» и соединение фрагментов уже на уровне ДНК.
