Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
В присутствии восстановленного кофермента в среде инкубирования ЛДГ и мембран ее активность статистически достоверно не отличается от таковой для свободного фермента. Итак, полученные результаты можно объяснить тем, что NADH, соединяясь с апоферментом, вызывает его конформационные изменения, которые затрудняют адсорбцию- фермента на подложке биологической природы. Эти данные согласуются с результатами ряда работ
(R. L. Melnick, H. 0. Hultin, 1973; Г. Jl. Ермаков, 1993; A. Dabrowska et al., 1989), в которых было показано, что NADH способствует десорбции фермента, связанного с мышечными волокнами лосося, липосомами и мембранами саркоплазматического ретикулума.
Ингибирование ЛДГ, ассоциированной с субклеточными частицами, происходит за счет увеличения константы Михаэлиса для пирувата, а не изменения максимальной скорости реакции (A, Dabrowska et al., 1989). Н. П. Сугробовой и соавт. (1983) показано, что связывание ЛДГ с F-актином не изменяет характера зависимости скорости реакции от концентрации субстрата — ос-кето-глутарата. В результате взаимодействия ЛДГ с F-актином максимальная скорость реакции снижается в 1,6 раза, а константа Михаэлиса увеличивается в 2,5 раза. Другие результаты получены при исследовании ЛДГ, ассоциированной с митохондриальной фракцией печени цыпленка (М. L. Sagrista, J. Bosal, 1987). Зависимость каталитической активности связанного фермента от концентрации пирувата отклоняется от гиперболической формы, а при изменении концентрации NADH описывается в рамках кинетики Михаэлиса—Ментен.
Считают, что имеющиеся в литературе противоречивые данные по этому вопросу можно объяснить двумя причинами: особенностями природы биологической подложки и природой самого фермента.
На рис. 51 показаны результаты исследования зависимости скорости ферментативной реакции ЛДГ, связанной с мембранами эритроцитов, от концентрации пирувата натрия при pH 7,4. Кинетические кривые для свободного фермента и комплекса фермент—мембрана подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен. Величина константы Михаэлиса для ЛДГ в растворе равна 0,25±0,02 ммоль/л пирувата, а для мембраносвязанной — 0,60±0,04 ммоль/л. Максимальная скорость ферментативной реакции при взаимодействии ЛДГ с мембраной эритроцитов снижается в 1,2 раза. Значит, ингибирование фермента происходит за счет увеличения в 2,4 раза константы Михаэлиса для пирувата натрия.
Суммируя результаты проведенных экспериментов, можно констатировать, что ассоциация ЛДГ с эритроцитарными мембранами и их белковыми компонентами, представляющими собой мембранный каркас клетки, при различных значениях pH среды приводит к снижению каталитической активности фермента, ко-
О,
О,
Рис, 51. Зависимость еко-рости ферментативной реакции лактатдегидрогеназы в свободном состоянии (/) и в комплексу с зритроцитарными мембранами (2) от концентрации ни-рувата натрия
то рое происходит за счет увеличения константы Михаэлиса для нирупата «атрия. Эффект ингибирования ЛДГ усиливается при сдвиге pH в кислую область, что свидетельствует об электростатической природе взаимодействий между ферментом: и мембраной. Следовательно, процесс образования комплекса ЛДГ с биологической подложкой можно регулировать путем варьирования концентрации водородных ионов, а также добавления в реакционную среду кофермента NADH.
Обратимое взаимодействие белков-ферментов е различными структурными компонентами клетки представляет собой один иа эффективных механизмов регуляции каталитической активности компонентов метаболических систем. В соответствии с атим функционирование ферментов в клетке можно рассматривать как совокупность взаимосвязанных процессов перехода их и а свободного состояния в связанное, которые регулируются путем воздействия различных физико-химических факторов и сопровождаются изменением функциональных свойств этих ферментом, а, следовательно, и изменением жизнедеятельности целой клетки.
Ни рис.. 52, и представлены результаты исследования каталиги» ческой активности ЛДГ, УФ-облученной в дозе 1,5 кД»/м* и ассоциированной с оритроцитарными мембранами при pH 7,4. Активность фермента в свободном состоянии после его облучении составляет 83 % по отношению к контрольному образцу.
(пируват), ммоль/л
А, % ЮОГ
А, % ЮОг
А, % ЮОГ
I
85 -
85 -
85 -
f
il 70-
55 -
55 -
55 ¦
40
40
40
2 3
2 3
б
2 3
В
а
Рис, 62. Активность лактатдегидрогеиазы, УФ-облученной в дозе 1,5 кДж/м2, в комплексе с эритроцитарными мембранами при pH 7,4 (а),
5,4 (0), 4,5 (в): 1 — активность УФ-облученной ЛДГ; 2 — активность ЛДГ в присутствии эритроцитарных мембран; 3 — активность ЛДГ, УФ-облученной в дозе 1,5 кДж/м2 и ассоциированной с эритроцитарными мембранами
Каталитическая активность УФ-модифицированной ЛДГ, ассоциированной с эритроцитарными мембранами, статистически достоверно уменьшается на 8 % по сравнению с активностью свободного УФ-облученного фермента.
Таким образом, степень инактивации УФ-модифицированной ЛДГ при pH 7,4 в связанном с эритроцитарными мембранами состоянии выше, чем в свободном состоянии (табл. 13).
