Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
распределения между разными клеточными компартментами.
Т. В. Есаковой и М. В. Ивановым (1992) показано, что связывание ЛДГ с мембранами саркоплазматического ретикулума ведет к снижению удельной активности фермента на 60—70 %. Высказано предположение о том, что взаимодействие фермента с мембранами происходит в участках с высоким и низким сродством. Добавление NADH, NAD+, а также повышение ионной силы раствора вызывает солюбилизацию связанного фермента. Снижение активности ЛДГ в связанном состоянии можно объяснить как маскировкой некоторых субъединиц, диффузионными затруднениями при связывании субстратов, конформационными перестройками молекулы ЛДГ, так и изменениями физико-химических свойств среды при переходе фермента из раствора в при-мембранный слой.
Взаимодействие мембран эритроцитов с ЛДГ приводит к снижению ее каталитической активности. На рис. 49 представлена зависимость ферментативной активности мембраносвязанной ЛДГ от величины pH среды инкубирования. В условиях оптимума pH 7,4 активность ее снижается на 25 %; при значениях pH 6,0 и 4,0 — соответственно на 33 и 46 %. Сдвиг pH в щелочную область приводит к уменьшению эффекта ингибирования ЛДГ. При pH 9,0 активности свободного и связанного ферментов статистически достоверно не отличаются.
По-видимому, с увеличением отрицательного заряда молекулы белка вероятность образования его комплекса с мембраной уменьшается. Можно предположить, что участки связывания фермента на мембране несут отрицательный заряд.
Эти данные коррелируют с результатами исследования
А, %
100
80
Рис. 49. Зависимость ферментативной активности лактатдегидрогеназы, связанной с мембранами эритроцитов (2-10-8 моль/л, 0,15 мг/мл белка мембран), от величины pH (за 100 % принята активность свободного фермента при тех
60
40
контроль 4,0
6,0 7,4 8,5 9,0
же значениях pH)
В. И, Лущака (1991, 1992), который изучил влияние pH среды на экстракцию ЛДГ из микросом плавательных мышц шиповатого ската и показал, что степень экстрагируемости фермента из микросомальных мембран увеличивается при щелочных значениях pH. Т. В. Есакова и М. В. Иванов (1992) считают, что для взаимодействия ЛДГ из скелетных мышц свиньи с мембранами саркоплазматического ретикулума важен отрицательный заряд мембраны. Кроме того, на поверхности мембраны существует положительный заряд, затрудняющий связывание ЛДГ.
Падение активности фермента в связанном состоянии может быть обусловлено следующими причинами (Б. И. Курганов, Н. И. Лобода, 1977; Б. И. Курганов, 1984):
а) стерическим экранированием активных центров при адсорбции;
б) изменением конформационного состояния белковой молекулы (или преимущественной адсорбцией одной из конформаци-онных форм фермента, находящегося в растворе);
в) изменением микроокружения фермента при переходе из раствора в примембранный слой (концентрации водородных ионов и субстратов в растворе и на поверхности могут различаться вследствие их взаимодействия с подложкой).
Однако убедительных доказательств в пользу какого-либо одного из этих предположений не получено.
Таким образом, процесс ассоциации ЛДГ с эритроцитарной мембраной можно регулировать путем варьирования значений pH среды. Следовательно, важную роль в образовании комплексов фермента с различными клеточными структурами играют электростатические взаимодействия.
При взаимодействии ЛДГ с тенями эритроцитов, обработанными тритоном Х-100, наблюдалось снижение каталитической активности ЛДГ, однако степень инактивации фермента была выше, чем в случае его ассоциации с препаратами нативных мембран. Так, связывание ЛДГ с эритроцитарными мембранами и их “три-тоновыми” тенями при pH 7,4 приводило к снижению ее активности на 25 и 82 % соответственно (рис. 50). При pH 9,0 каталитическая активность ЛДГ в присутствии нативных и тритоновых теней статистически достоверно не отличалась от таковой для свободного фермента. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ЛДГ эффективнее взаимодействует со спектрин-актино-
Рис. 50. Каталитическая активность лактатдегидрогеназы в комплексе с эритроци-тарными мембранами и трито-новыми тенями эритроцитов (2-10~8 моль/л, 0,15 мг/мл белка мембран): | | — изолиро-
ванные мембраны; f^\1 — ТРИ-тоновые тени
7.4 9.0 рн
вой сетью, представляющей основу мембранного каркаса клетки. Можно предположить, что преобладающий вклад в образование комплекса фермента с эритроцитарной мембраной вносит его ассоциация с элементами цитоскелета, прежде всего актином и спектри-ном. Это соответствует концепции о центральной роли актина как белка-координатора в регуляции обменных процессов в клетке, предложенной Б. Ф. Поглазовым и соавт. (1983).
При взаимодействии эритроцитарной ЛДГ с нативными и модифицированными тритоном Х-100 мембранами эритроцитов активность связанного фермента снижается при pH 7,4 на 21 и 30 %, а при pH 5,4 — на 35 и 41 % соответственно. Следовательно, изменения каталитической активности фермента из скелетных мышц и эритроцитов в ассоциированном с эритроцитарными мембранами состоянии имеют идентичный характер и указывают на единый механизм ассоциации мембран эритроцитов с ЛДГ из названных источников.
