Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
поля вокруг наиболее важного в каталитическом; отношении “горла” ацетилхолинэстеразы, включающего серин, гистидин и глутамат. Из результатов исследования pH-зависимости действия холинэстераз следует, что их активность связана с функциями группировки, рК которой составляет 8,5— 10,0. К таким группировкам может быть отнесен гидроксил тирозина. В образовании фермент-суб-стратного комплекса ацетилхолинэстеразы участвует в качестве обязательных не менее трех связей. Во всех современных схемах механизма действия холинэстераз фигурируют: гидроксил серина, связанный с имидазолом гистидина, — в качестве постулированной Уилсоном нуклеофильной группировки эстеразного центра; ионизированная карбоксильная группа — в качестве анионного центра; гидроксил тирозина — в качестве кислотной группы эстеразного центра.
Считают, что каталитический процесс (рис. 13) начинается с образования электростатической связи между катионом субстрата и анионной группировкой фермента. Нейтрализация отрицательного заряда одной из групп белковой молекулы в сочетании с взаимодействием трех метильных групп при атоме азота ацетилхолина с окружающими анионный центр группами приводит к существенным изменениям конформации фермента. В результате этого группировки эстеразного центра и соответствующие группы субстрата занимают положение, обеспечивающее установление “наилучшей” комплементарное™, а затем образуются связи между углеродом поляризованной карбонильной группы и кислородом гидроксильной группы серина и, возможно, между эфирным кислородом и водородом кислотной группировки (остаток тирозина). Далее происходит переход протона к холину с образованием ацетилированного по гидроксилу фермента и про-тонированного имидазола. Следующий элементарный акт с участием воды осуществляется после того, как молекула холина по-
pH
Рис. 12. Зависимость скорости гидролиза ацетилхолина от pH для ацетилхолинэстеразы Torpedo marmorato (1) и холин-эстеразы сыворотки крови (2)
кинет анионный центр фермента и восстановится отрицательный заряд анионной группировки. Молекула воды образует связи с карбонильным кислородом и кислородом тирозина, в результате чего происходит переход протона к гидроксилу серина. При этом выделяется второй продукт реакции — уксусная кислота — и регенерируется фермент в исходной конформации.
Эксперименты Е. Krejci и соавт. (1991) с направленным мутагенезом показали, что консервативный для эс-тераз и липаз остаток аспарагиновой кислоты необходим для осуществления ими каталитических функций. По-видимому, электростатические особенности поверхности молекулы ацетилхолинэстеразы не влияют на скорость катализа, которая не зависит от диффузии молекул субстрата, а стабилизация переходных состояний в каталитическом центре нечувствительна к электростатическим взаимодействиям.
Для выделения ацетилхолинэстеразы из эритроцитов используют метод экстракции фермента из стромы щелочным буфером в присутствии нейтрального детергента Твин-20 с последую-
^COCH2CH2N (СНэ)з Н3С II но—j? тир
о
¦ СН пглпГ
, iN-^HrO HN—* ^1
COO
няс
^C-OCH2CH2N (СНэ)з
л
(о
ПТПЯ I 0ЧПП1ПШП1И»11ИПП(^'
xU
.../Т\................,
I 2
-нт6 ч
соо"
“Vi/
imrmmmrmnrv
Рис. 13. Схема механизма действия холинэстераз
щим фракционированием сульфатом аммония и отделением гемоглобина с помощью кальций-фосфатного геля. Молекулярная активность (т.е. число молекул субстрата, претерпевающих превращение на одном активном (каталитическом) центре фермента в 1 мин в условиях насыщения фермента субстратом) ацетилхолинэстеразы составляет ~ (3—3,5)-105 мин-1 и превышает в 4—
5 раз таковую для холинэстеразы сыворотки крови.
Зависимость lg v от 1/Т для ферментативного гидролиза эфиров холина холинэстеразой сыворотки крови лошади (график Аррениуса) в интервале температур 10—25 °С является линейной (рис. 14). В случае гидролиза ацетил-(З-метилхолина константа Михаэлиса не зависит от температуры, для ацетилхолина и бен-
19(Чпах'Ю )
1/Т-103
Рис. 14. Зависимость lgv от 1/Т для ферментативного гидролиза эфиров холина при действии холинэстеразы сыворотки крови лошади: 1 — адетилхолин; 2 — бутирилхо-лин; 3 — ацетил-р-метилхолин; 4 — бензоилхолин
зоилхолина — незначительно растет по мере ее повышения, а для бутирилхолина — существенно увеличивается.
Ацетилхолинэстераза эритроцита расположена на внешней поверхности мембраны и составляет 0,2—0,3 % от всего мембранного белка. Она является гликопротеином, в состав которого входят гликано-вые компоненты, содержащие последовательность: этанола-мин — фосфатманноза — глю-козамин — инозитол. Фермент может быть экстрагирован в форме активного липопротеи-на при обработке мембраны растворами высокой ионной силы, Na-дезоксихолатом или три*оном Х-100. Удаление липида приводит к полной потере активности фермента, а последующее добавление фос-фатидилсерина (липида, с которым он выделяется из мембраны) — к восстановлению ее функциональных свойств.
