Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
К
+ о о
Рис. 9. Схема реакционного цикла Na+, К+-АТФазы (А. А. Болдырев, 1998)
Примечание. Шесть основных последовательных реакций включают связывание ионов натрия Ех-конформером, его взаимодействие с АТР и образование фосфорилированного интермедиата (стадия 1), окклюзию ионов Na+ конформацией EtP (стадия 2), активируемый ионами Mg2+ переход EjP -» Е2Р, приводящий к высвобождению ионов Na+ во внеклеточную среду и связыванию с ионным центром внеклеточного калия (стадия 3), окклюдирование ионов К+ (стадия 4), дефосфори-лирование фермента, вследствие которого ионы К+ высвобождаются во внутриклеточное пространство (стадия 5), и переход конформации Е2 в конформацию Ej, обусловливающий начало нового цикла (стадия 6).
тина. КМАТР для солюбилизированной Ма+, Е+-АТФазы зависит от pH среды: при переходе от физиологических значений pH в щелочную область Км существенно уменьшается (рис. 10, б). Кривая зависимости рКм от величины pH представляет собой восходящую ветвь, что свидетельствует о присутствии в фермент-суб-стратном комплексе ионизирующейся группы с рК 7,60. Таким образом, и в случае гидролиза субстрата солюбилизированным ферментом процесс контролируется аминогруппами со значениями рК в узком интервале pH: 7,25 — 7,70.
К моменту создания модели активного центра Na+, К+-АТФа-зы, реконструированной с помощью методов ЯМР- и ЭПР-спект-роскопии, не была установлена природа группы, высвобождающей протон при переходе из К-формы в Na-форму (или акцептирующей его при превращении). Ею может быть NH2-rpynna ли-
а б
Рис. 10. Зависимость активности солюбилизированной Na+, К+-АТФа-зы от pH: а - pH-зависимость Na+, К+-АТФазы (lg v = f(pH)); б - зависи-мость Км(АТР) Na+, К+-АТФазы от pH
зина (J. Skou, 1983) или ОН-группа тирозина, имеющая близкое значение рК (-8,0). Обе группы идентифицированы в активном центре Na+, К+-АТФазы.
Для Na\ К4-АТФазы обнаружена нелинейная зависимость ферментативной активности от температуры в координатах Аррениуса (рис. 11). В температурном интервале 10 — 35 “С наблюдается “перегиб” на графике Аррениуса в области 20 “С, при этом энергия активации каталитической реакции повышается с 18 ккал/моль при температурах выше 20 “С до 30 ккал/моль при более низких температурах (А. А. Болдырев, 1988). На основании результатов сравнительного изучения температурной зависимости активности v, мкмоль Рп/мг в ч Na+, К+-АТФазы и исследования методом ЭПР параметров, характеризующих структурное состояние мембранных липидов, автором сделано заключение о том, что конформационный переход молекул фермента при изменении температуры в состояние с более высокой энергией активации обусловлен фазовыми перестройками липидного окружения при условии взаимодействия белковых молекул с липидным матриксом с участием гидрофобных и электростатических сил. Примечательным
3,3 3,4 3,5
103/Т, К“1
Рис. 11. Температурная зависимость начальной скорости гидролиза АТР Na+, К+-АТФазой мозга
является тот факт, что нелинейный характер графиков Аррениуса для Na+, К+-АТФазы наблюдается лишь в случае использования в качестве субстрата АТР, что свидетельствует о выполнении последним не только функции субстрата, но и модификатора.
Na+, К+-АТФаза способна гидролизовать большое количество субстратов: нуклеозидтрифосфаты, ацетилфосфат, умбеллиферон-фосфат, карбамоилфосфат, динитрофенилфосфат, (3-фурилакри-лоилфосфат. Сложная кинетика ферментативной реакции, характеризующаяся наличием двух значений Км, проявляется только при гидролизе АТР и СТР; превращения других субстратов подчиняются кинетике Михаэлиса. Na'\ К+-АТФаза активируется при одновременном присутствии ионов Na+ и К+ в среде. Вид зависимости активности фермента от соотношения Na+/K+ определяется природой субстрата реакции.
Считают, что структурной единицей Na+, К+-АТФазы является димер (оф)2, а минимальной функциональной единицей — (оф)-протомер (или а-субъединица). Олигомерный ансамбль ((а|3)2-димер) АТФазы поддерживается в основном за счет взаимодействий а-субъединиц с цитоплазматической стороны в “районе” ATP-связывающих центров, что обеспечивает стабильность четвертичной структуры, необходимой для проявления функциональной активности белка. Вместе с тем с функциональной точки зрения каждая а-субъединица в стабилизированном состоянии обладает полной гидролитической и транспортной активностью. Однако вопрос о биологической роли олигомеров фермента, образуемых в мембране, изучен далеко не полностью. По-видимому, наличие олигомерной структуры Na+, К+-АТФазы обеспечивает возможность реализации “гибких механизмов”, контролирующих активность мембраносвязанного фермента (см. раздел 2.3.3).
Данные, касающиеся кооперативных взаимодействий между ионными центрами и гидролизующими субстрат участками, служат основой для представлений о том, что Na+, К+-АТФаза не только структурно организована, но и использует взаимодействия между протомерами для регуляции их активности. При этом величины коэффициента Хилла пн по ионам-активаторам отражают взаимодействие между ионными центрами, локализованными на каждом протомере, а по субстрату — взаимодействие между протомерами. Чувствительность пн по АТР к фазовому состоянию мембранных липидов подтверждает, что эта величина отражает взаимодействие разных протомеров АТФазного комп-
