Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Фосфатидилэтаноламин 33 ± 7 33 ±4,5
Углеводы, моль/100 молей а-субъединица [3-субъединица
аминокислот
Манноза 0,3 ± ОД 2,5 ±0,1
Галактоза 0,9 ±0,1 5,5 ± 0,4
Глюкоза 0,9 ±0,2 2,0 ± 0,5
Глюкозамин 2,0 ± 0,2 10,1 ± 0,5
Галактозамин Отсутствует 0,3 ± 0,1
Сиаловые кислоты 0,35 ± 0,05 3,2 ± 0,2
го входит более 400 аминокислотных остатков а-субъединицы. Большой цитоплазматический домен состоит из чередующихся а-спиральных и (З-складчатых участков. Характерной его особенностью является наличие центрального ядра, представленного (3-структурой, которое окружено,а-спиральными участками, соединенными гибкими петлями. ATP-связывающий центр расположен, вероятно, в С-концевой части (3-структуры. В большом цитоплазматическом домене а-субъединицы находится фосфорилируемый остаток аспарагиновой кислоты (Asp 369). Полипептидная цепь (3-субъединицы уложена в антипараллельные [3-структуры. Все изоформы (3-субъединицы содержат три дисульфидные связи (Cysl21— Cysl50, Cysl60—Cysl76, Cys215—Cys278 в (31-изоформе).
Молекулярная масса белковых субъединиц в среднем составляет 90—130 (а) и 35—57 ((3) кДа. В очищенных препаратах Na\ К+-АТФазы рядом исследователей отмечено присутствие низкомолекулярного протеолипида с молекулярной массой 10000—15000 выраженной гидрофобной природы. Его называют у-субъединицей Na+-Hacoca. Предполагают, что подобные протеолипиды способствуют образованию трансмембранных ионных каналов в мембране или обеспечивают взаимодействие олигомерных белков с бислоем.
Основной формой Na+, К+-АТФазы, встречающейся у млекопитающих, является изофермент ос1(31-типа. В 1986 г. G. Е. Shull et al. опубликовали данные о полной последовательности трех клонов кДНК из мозга крысы, соответствующих трем различным изоформам каталитической субъединицы белка (al, a2, оЗ) и представляющих собой продукты трех неодинаковых генов. У различных видов животных обнаружено пять изоформ (3-субъединицы, входящих в состав Na+, К+-АТФазы и Н+, К+-АТФазы ({31,(32, [33, Н, К(3 и (ЗЫ).
Деление протомера фермента на а- и [3-субъединицы условно: под электронным микроскопом а(3-протомер выглядит как цилиндр с диаметром 5,4 нм и высотой 8,0 нм. Для проявления функциональной активности фермента необходим по меньшей мере димер с молекулярной массой 265 ООО. Однако в последнее время получены активные препараты Na+, К+-АТФазы, находящиеся в мономерном состоянии.
Na+, К+-АТФаза представляет собой векторную систему первично-активного транспорта, обеспечивающую сопряжение энергии ферментативного гидролиза АТР с трансмембранным проти-воградиентным переносом Na+ и К+:
ATP + Н20 -> ADP + Рп,
3Na+ + 2К+ + АТР <-» 3Na+ + 2К+ + ADP + Р ,
вн сн сн вн п
Свободная энергия гидролиза АТР составляет в условиях клетки ~ 55 кДж/моль, а для транспорта указанных ионов требуется » 46 кДж/моль, т.е. коэффициент полезного действия натриевого насоса равен 84 %. Натриевый насос работает в электроген-ном режиме: за каждый транспортный цикл из клетки “выносится” один положительный заряд. В результате на внутренней стороне плазматической мембраны создается отрицательный потенциал порядка 90 мВ.
Используя технику миллипорового фильтрования, Y. Топо-mura (1979) обнаружил в ферменте, выделенном в чистом виде из почек свиньи, участки специфического связывания Na+ (3 моля/моль фермента) и К+ (2 моля/моль фермента), что согласуется как со стехиометрией транспорта ионов в оптимальных условиях (Na+/K+/ATP = 3/2/1), так и с результатами определения коэффициентов кооперативности для ионов, рассчитываемых по активации калием и натрием АТФазной реакции. Коэффициенты Хилла по ионам равны: пн по К+ ~ 1,7; по Na+ ~ 2,3. К, для Na+
в Na+-n;eHTpax составляет 0,2—0,3 ммоль/л, а в К+-центре — 2,2 ммоль/л. Ион К+ обнаруживает высокое сродство не только к собственным центрам (Kd = 0,04 ммоль/л), но и к Na'-центрам. Каждый протомер Na+, К+-АТФазы содержит один нуклеотид-связывающий центр, локализованный на а-субъединице. В присутствии Na+, Mg2+ , ATP он может фосфорилироваться, образуя ацилфосфат на карбоксиле аспарагиновой кислоты. Образование фосфофермента — одна из стадий гидролиза субстрата Na+, К+-АТФазой, а К ' обеспечивает его быстрое дефосфорилирование (Kd для АТФ — 0,1-*-1,0 мкмоль/л). Показано существование двух типов АТР-связываюгцих центров, что позволяет получить двухфазную кривую субстратной зависимости фермента.
Предложены три гипотезы функционирования фермента (R. W. Albers — R. L. Post, 1969; J. D. Robinson, 1975; К. R. H. Rep-ke, 1979), основанные на результатах как экспериментальных исследований, так и теоретического анализа.
В основу реакционной схемы (A. G. Sen, R. W. Albers, R. L. Post, 1969), включающей стадию, протекание которой требует наличия высокой концентрации Mg2+ , положен тот факт, что для процесса фосфорилирования требуется присутствие гораздо меньшего количества Mg2+ , чем для полного гидролитического цикла:
