Введение в методы микроскопического исследования - Аппельт Г.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 103. Принцип освещения по методу темного поля. Лучи, освещающие объект, проходят, минуя объектив.
в) Все точечные объекты, размеры которых приближаются к длине волны света или меньше ее.
а — центральная диафрагма; б — объект; в — объектив; г — плоскость объекта; д — оправа конденсора; е — линза конденсора; ж — лучи, освещающие объект.
центральная диафрагма; б — объект; ^ А
объектив; г — плоскость объекта; ОЛЮдеНИИ В Т6МНОМ ПОЛе
оправа конденсора; е — линза кон- OTTTCJwr/»cT*
не
а) Неоднородные объекты с плоскими поверхностями, особенно если их толщина превышает глубину зрения объектива.
б) Объекты, структуры которых становятся видимыми благодаря разнице в поглощении света. По этой причине окрашенные объекты с плоскими поверхностями исследуют обычно при освещении по методу светлого поля (отклонения от этого правила см. в разделе 6.5 настоящей главы).
Для достижения хорошего освещения по методу темного поля необходимо соблюдать следующие условия:
1. Объект должен стать видимым благодаря отклоненному свету. Наибольшей интенсивностью должны обладать краевые лучи.
2. Все лучи, падающие прямо в объектив, исключаются, благодаря чему поле зрения становится темным.
3. Размеры объектов не должны значительно отличаться друг от друга, так как в противном случае ореол, возникающий вокруг более крупных частиц, осветляет темное поле. Мелкие объекты, находящиеся поблизости от крупных, становятся тогда совсем невидимыми, подобно тому как вблизи полного месяца остаются невидимыми звезды.
Для выполнения этих условий существуют различные пути. Вначале Зидентопфом и Зигмонди был сконструирован «щелевой ультрамикроскоп». Объект освещался со стороны пучком света, который, пройдя через узкую щель, падал перпендикулярно к оптической оси микроскопа. С течением времени были разработаны новые способы освещения по методу темного поля; все они основаны на следующем.
Если в объектив не будет попадать ни один прямой луч, то осветительная апертура = АК должна быть больше численной апертуры А применяющегося объектива. Если, например, А составляет 0,65, то все лучи с АЯ=0,00—0,65 срезаются, чтобы исключить попадание прямого света в микроскоп. Для освещения применяют более или менее косо падающие лучи с высокой апертурой. Для этих лучей остаются в силе законы косого освещения (см. главу 5, раздел 5.4).
По техническим причинам применяют объективы с относительно небольшой апертурой для того, чтобы с внешней стороны затемненной области, соответствующей апертуре, могло бы падать еще достаточно света.
Азимут лучей, освещающих объект, т. е. угол, в пределах которого лучи падают на объект, может составлять 360°, но может быть и значительно меньше. В последнем случае, когда свет падает только с одной стороны (см. рис. 105), возможность оптических искажений еще больше, чем при применении косого освещения в условиях светлого поля, так как лучи падают здесь еще более косо.
Если апертура объектива превышает 1,00, то ее следует уменьшить путем диафрагмирования. Для этой цели в объек-
тивы помещают концентрические диафрагмы. У некоторых объективов апертуру можно уменьшать с помощью ирисовой диафрагмы по градуированной шкале, от наибольшей величины 1,25—1,30 до 0,80. Специальные объективы для наблюдений в темном поле имеют незначительную апертуру.
6.2. УСТАНОВКА ОСВЕЩЕНИЯ ПО МЕТОДУ ТЕМНОГО ПОЛЯ
НА ПРАКТИКЕ
Освещение по методу темного поля может быть достигнуто различными способами.
1. При помощи центральных диафрагм, которые вкладывают в держатель, находящийся под конденсором светлого поля. Поверхность центральной диафраг-
Рис. 104. Центральная диафрагма. Рис. 105. Поперечный разрез через конденсор при освещении по методу темного поля с децентриро-ванной апертурной диафрагмой конденсора.
а — поперечный разрез через отверстие конденсора; б — кольцо* ограничивающее апертуру объектива; в — отверстие ирисовой диафрагмы.
мы должна иметь диаметр, соответствующий такой осветительной апертуре, которая равнялась бы апертуре объектива. Практически ее делают несколько больше во избежание переосвещения. В том случае, когда для освещения применяют лучи с апертурой выше 1,00, на конденсор следует наносить иммерсионное масло, чтобы избежать полного внутреннего отражения лучей на верхней линзе конденсора, диафрагма которого полностью открыта.
Если применяют конденсоры с апертурой АК 1,4, то при использовании сухих объективов возникает особенно глубокое темное поле, так как лучи, АК которых составляет
1,4, вследствие своего падения под косым углом испытывают полное внутреннее отражение на верхнем крае покровного стекла.
Как сделать самим центральные диафрагмы и как определить их размеры?
Центральные диафрагмы можно приготовить из жести или картона. Их размеры нетрудно определить. Устанавливают препарат на резкость, соблюдая принцип освещения Кёлера, и смотрят в микроскоп с удаленным окуляром. Затем открывают затянутую диафрагму конденсора до тех пор, пока ее края не совпадут с краями задней линзы объектива. Для предотвращения незначительных, но всегда возможных ошибок и случайного засвечивания темного поля желательно, чтобы диаметр центральной диафрагмы был на 3 мм больше установленного диаметра диафрагмы конденсора.
