Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
К + [S ] +
в о
Рис.51. Активация и ингибирование субстратом График в координатах Лайн;,пзера-Берк^ для гидролиза N-карбобензоксиаланилфенилаланина, катализируемого карбоксипептидазой А (25°С; pH 7,5; [Е]о=5,4-Ю-9 М) [1738]
Рис.52. Кинетические зависимости для аллосте-ричэских ферментов в прямых (а), двойных обратных (б) и логарифмических (б) координатах [1737]
Типичный график зависимости 1/и от 1/[S 3 о для случая ингибирования и активации субстратом представлен на рис.51 [1738].
при больших концентрациях субстрата (левая ветвь графика) уравнение (38) можно преобразовать к виду (так как Ks«[S]о):
э [S3
г о
1 +-------
к' = -------- = -------------
[Е] 2 [S]
о о
1 +-------
К'
в
ИЛИ
1-fe'/ft_ 1-0 1-0 [S]
d о
Зависимость 1/(1-*'/*2) от 1/[S]о будет иметь вид прямой, из наклона которой и пересечений с осями можно найти значения р и Г.
Хотя среди амидгидролаз очень немного ферментов, проявляющих кооператив-ность при связывании субстрата, все же такие случаи имеются, и поэтому необходимо описать простейшие способы их анализа (см. обзор:[17373). Коопера-
тивное связывание предполагает наличие в молекуле фермента нескольких центров связывания субстрата, причем связывание в одном из них или увеличивает сродство другого центра к субстрату (положительная кооперативность), или снижает его (отрицательная кооперативность). Ферменты, проявляющие такие свойства, называются аллостерическими. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата в случае положительной кооперативности представляет собой сигмоиду (рис.52,а,б). Анализ кинетики аллостерических ферментов проводят по уравнению Хилла [17393:
lg --------- = n(lglS3 - lglS] ),
V - v •
max
где [S]0 - концентрация субстрата, при которой t’=vmax/2; п - коэффициент
Хилла, показывающий степень кооперативности связывания. При п= 1 кооперативность отсутствует, при п>1 наблюдается положительная кооперативность, а при п<1 - отрицательная.
Уравнение Хилла выполняется в относительно узком интервале концентраций субстрата и коэффициент п можно определить в этом интервале из графика зависимости lg(Vnax-v) от IgtS]о (рис.52,6) как наклон кривой в точке полуна-сыщения [т.е. в точке lg(Vmax-u)=0]. Предложены также и другие методы определения коэффициента Хилла для тех случаев, когда Vmax неизвестно [1740, 17413 - В случае димерного фермента возможна ситуация, когда связывание субстрата одной субъединицей дестабилизирует комплекс другой субъединицы. При этом возникает так называемая полуцентровая реактивность [17423.
Отклонения от гиперболической зависимости скорости от концентрации субстрата могут возникать при олигомеризации фермента, что сопровождается изменением активности вследствие маскирования части активных центров. В простейшем случае, когда образуются линейные ассоциаты так, что стерически экранируются все активные центры за исключением расположенного на конце оли-
(39)
(40)
Рис.53. Схема олигомеризации фермента с экранированием активных центров
гомерной цепи (рис.53), активность ассоциата будет связана с концентрацией фермента соотношением:
2а1
а =------------------,
1+Л
+ 4Я[Е]
где а - удельная активность ассоциата; а1 - удельная активность мономера;
К - константа ассоциации мономер — N-мер (предполагается равенство констант ассоциации на каждой стадии) [1743].
4.2. Связь скоростей и равновесий
Как и всякий катализатор, фермент не изменяет положения равновесия химической реакции. Однако для ферментативных реакций имеется одно обстоятельство, на которое следует обратить внимание. Ферментативный катализ, как правило,
- многостадийный процесс, поэтому константа равновесия такого процесса -сложная величина, которую можно представить через константы равновесия отдельных стадий ("микроскопические" константы, К{):
*1 йг Ki-i Е + S «—=• ES ___________«г----=. EQ Е + Р, (41 )
[Р] i К = ------ = ПК..
eg [S] 1 {
Поскольку для любой стадии К{=&_{/&{, то выражение (41) можно написать в виде:
“Пй ,
-1
(42)
i
ПЙ. ¦1 {
Это соотношение известно как уравнение Холдена [1744], связывающее константы скоростей с термодинамической константой равновесия реакции. Уравнение (42) можно записать через изменение свободных энергий:
ДGo =1 AGf{ - Е ДG*, (43)
где aG - изменение стандартной свободной энергии реакции; lG* - свободные
