Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Гидролиз этилового эфира N-ацётил-
L-фенилаланина (25°С; 0,1 н. КС1;
[Е]о=1 ,03-10_s М) в отсутствии и присутствии 0,11 Ми 0,22 М 1,4-бутанди-ола
но показать, что в координатах 1/у ¦*
¦* 1 /CS]q две прямые (соответствующие v и v*) будут пересекаться в точке с координатами 1/[S]o=-1/i?e и 1/v=
=1/^3[Е]о (рис.49). Отсюда, зная Кд и k3, легко найти &2 [1722-1724].
В качестве эффекторов а-химотрип-сина были предложены борная кислота, ионы меди, спирты и др. [1722,1723, 1725,1726].
Наконец, третий метод (метод Бойера [1727]) заключается в исследовании скорости включения в субстрат меченных изотопами продуктов реакции в условиях термодинамического равновесия системы.
Для схемы
*2 *3
-----* ЕА Е + Р„
к-г + к-з
(30)
равновесие может быть достигнуто введением продуктов Р и Р2 в концентраци-¦ ях, удовлетворяющих условию
К = [Р.][P_]/[S].
eg 12
Если Р1 и Р2 содержат радиоактивную метку, то эта метка будет включаться в субстрат (S). Измеряя скорость появления метки в субстрате в зависимости от различных равновесных концентраций Р1 и S или Р2 и S, получают кривые типа показанной на рис.50. Скорости включения Р и Р2 (соответственно R' и R) даются уравнениями [17?7,17281
R'(R)-WS М-мин~1
[Е]
R =
,V*-2lP1]
*2*3
*1 *2 )(1 + — + —) [S] [Р^
(31
РИС.50. Зависимость скорости включения N-ацетил-Ь-фенилаланина (г) и гли-цинамида (2) в N-ацетил-Ь-фенилаланилглицинамид от концентрации глицинамида
(pH 8,2; время инкубации 30 мин; [Б] =1б-10“4 М) [1729]
шо
R' = --------------------------------, (32)
11 Й1 Ч
(---- + —)(1 + - + --)
tS] [Р^
где К^=К и Кг=кг/Ь_г. В пределе при [S]»^ и [Р1 ]»Я2 и при условии, что k »fe_, получим Я'=йДЕ] . Зная , можно найти L и J , а из зависимости
~ 1 С- <— О с. о 8
R' к-г
— = 1 + -----[Р.] (33)
R k3 1
найти й_2- Наконец, k_3 можно вычислить из соотношения Холдена (см. разд.
4.2):
К
*2*3
eQ V-2*-3
Этим методом были получены все индивидуальные константы гидролиза N-аце-тилфенилаланклглицинамида химотрипсшюм [1729-1731], а тлкке исследован гидролиз некоторых пептидов пепсином [1732].
4.1.5.2. Метода предстационарной кинетики
Эти методы описаны в многочисленных руководствах [1733-1736], и здесь мы рассмотрим лишь един пример. Пусть необходимо определить индивидуальные константj гидролиза п-нитрофенилового эфира ациламинокислоты, катализируемого химотрипсином. Реакция идет по схеме (7). Для этого необходимо измерить скорость образования нитрофенола на предстационарной стадии, что можно сделать с помощью аппарата остановленного потока, в котором реагенты смешиваются и изменение оптической плотности регистрируется в течение нескольких миллисекунд. Если эти опыты провести в .условиях [E]q>[S]o при разных начальных концентрациях фермента, то можно получить зависимость изменения концентрации продукта от времени для разных значений Эти величины
связаны выражением:
Й2Шо
IP, 1 = [S] [1 - ехр(---------t)] (34)
1 ° К +[Е]
S о
Таким образом, эффективная константа скорости процесса
^г^о 1 1 1
к' = ------- или — =--------------------+ —. (35), (36)
К +Ш к' к0 [Е] fe,
so 2 о 2
Строя ва^жсимость 1 /к' [вычисленное из уравнения (34)] от 1 /[Е]о, получим прямую с наклоном Кд/&2 и отсечением на оси ординат 1/&2.
Наряду с методом остановленного потока широко используются релаксационные методы - температурного и pH-скачка, ультразвуковой релаксации и др.
4.1.6^ Отклонения от кинетики Михаэлиса-Ментен
Отклс^нения от кинетики Михаэлиса-Ментен в реаЛ'доях. катализируемых амидгид-ролайами, возникают обычно в следующих случаях- 1) когда субстрат выступает одновременно в роли эффектора (ингибитора или активатора); 2) когда имеет меего кооперативное связывание субстрата субъединицами фермента; 3) когда молекулы фермента взаимодействуют друг с другом, изменяя при взаимодействии сродство к субстрату [17371-
Случаи ингибирования и активации субстратом описьваютея кинетической схемой:
Е + S ES -> Е + Р (37)
К'
ES.
ES + Р.
Соответствующее выражение для скорости образования продукта Р будет [16591:
P*g[S]0
(*g +
К’
-) [Е] [S3
' г-\ г
V =
(38)
[S]c
