Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Е + S
ES*
+
Р.
Е + Р.
2’
Кривая накопления продукт а Р1 во времени
как показано на рис.47. Экстраполируя прямую стадии процесса к нулевому времени, можно получить связанную с константами скоростей соотношением:
(18)
будет при этом выглядеть *гак, соответствующую стационарной величину "выброса" (тс),
если й ¦ »t2, то зс = [Е]с
г.
(19)
Удзч^^ми субстратами для титрования активных центров сериновых протеиназ являются тракс-циннамоилимидазол, п-нитрофенилацетат [1208], нитрофениловые эфиры N--защищенных аминокислот Н6841, а также аминокислотные производные родамина [1685,16861. Последние позволяют титровать фемтомольные концентра -ции ферментов. Предложен интересный титрант сериновых протеаз на основе бычьего панкреатического трипсинового ингиби?опа (БПТИ), в котором остаток лизина активного центра заменен на нитроанилиды различных аминокислот.
Отщепление нитроанилина приводит к регенерации ингибиторных свойств БПТМ и реакция с ферментом имеет стехиометрический характзр И 687].
Наиболее общим метидом определения аб< олютной концентрации фермента является измерение скорости гидролиза субстратов в условиях [Е]о«>ЕS]о [1659, с.
114].
В сответствии с уравнением
Рис.47. Кинетика образования п-нитрофе-нола в реакции гидролиза п-нитрофенил-ацетата, катализируемой а.-хи’лотрипоином для двух концентраций фермента (а и б)
t, мин
---- =--------------, (19а)
1+Л X [Ж] ЕЖ]
О о
где А=1 / ), график в координатах 1/(1 +Л,) от [SWA, -имеет наклон,
равный 1/[E]q.
В тех случаях, когда определить абсолютную концентрацию активных центров по каким-либо причинам не удается, ограничиваются измерением активности фермента, выражая ее как количество фермента, необходимое для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин. Предложено большое число субстратов и способов, в том числе автоматических [1688], позволяющих определить очень низкие концентрации амидгидролаз [1689-1714]. Некоторые из используемых для этой цели субстратов перечислены в табл.33.
Таблица 33. Некоторые субстраты, используемые для чувствительного определения активности амидгидролаз
Субстрат Фермент Метод Чувстви Литера
тель турный
ность , нг источ
ник
Сукцинилальбумин + Пепсин Ф 1 [1694]
флуоре скамин
1г51-гемоглобин (тв) Трипсин Р 0,2 [1700]
14С-еластин (тв) Эластаза Р 1 [1700]
КМ-лизоцим (цитохром С) Трипсин X 2,5-10 [1706]
Химотрипсин
Казеин-(3-глюкозидаза (тв) Трипсин Фр 0,3 [1701 ]
Химотрипсин 0,3 [1701 ]
Плазмин 30 [1701 ]
Бромелаин 30 [1701 ]
Овомукоид + трипсиноген Энтеропептидаза X 2 [1714]
ЬеиШг+лейщшдегидро- Лейцинаминопеп- Фр --- [1702]
геназа тидаза
3H-BzPhe-Ala-ArgOH Карбоксипепти Р 0,01 [1713]
даза Н Р [1689]
Карбоксипепти
даза В
Gln-His-Phe.T-Phe-Ala- Пепсин Сп 100 [1703]
-LeuNH2 w Катепсин
Катепсин D
ZPheOMC Химотрипсин Ф 2 [1705]
N-пептидил-АМС Фактор коагу Ф 5-50 [1693,
ляции <1 1695,
Тромбин 1711 ]
Калликреин
Урокиназа
и др.
7-(GltPheHH-)4MC1 Химотрипсин Ф 10 [1708]
AntLys-p-NA* Трипсин Ф 25 [1709]
Dns-D-Ala-Gly-PheN-Gly* Энкефалиназа Ф - [1704]
ZLysSBzl Калликреин S «4 [1697]
