Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Основываясь на значительном увеличении рКа уходящей группы при образовании тетраэдрической конфигурации карбонильного углерода (см. разд.3.3.3), можно предположить, что перенос протона с имидазола на уходящую грушу происходит еще до сформирования тетраэдрического промежуточного соединения, поскольку уже на ранних этапах его образования происходит выравнивание значений рКа имидазола и уходящей группы. Однако изучение методом 13С-ЯМР комплексов трипсина с галоидметилкетонами [1160,3305] и pH-зависимости ингибирования химотрипсина этими веществами [3298] показало, что рКа имидазола в гидратированных комплексах, моделирующих тетраэдрическое промежуточное соединение, не менее 10.
Таблица 77. Энергии различных взаимодействий тетраэдрического
соединения, образованного АсТгрХ и химотрипсином [3306]
Вз аимодейс твие дЯ , ккал/моль Разница
о
i-форма .D-форма (i-D)
Связывающая энергия 19,5 19,5 0
0_-атом с NH- Gly193 и СО- Met192 -5,3 -4,7 -0,6
0_-атом с ИН- Seri 95 и СО- Asp194 -5,2 -3,2 -2,2
0_-атом с СО- Sei>214 0,6 0,8 -0,2
ИН- Ас с ЫН- Gly193 и СО- Met192 -0,1 0,2 -0,3
ИН- Ас с NH- Ser195 и СО Авр194 -0,1 0,1 0,2
NH- Ас с СО- Ser214 -1,8 0 -1,8
Другие Ван-дер-ваальсовы -113,6 -111 ,0 -2,6
взаимодействия
Все несвязывающие взаимодействия -125,5 -117,8 -7,7
Все связывающие и не связывающие -106,0 -98,3 -7,7
взаимодействия
Тетраэдрическое промежуточное соединение в тех случаях, когда оно образуется, должно быть стабилизировано большим числом взаимодействий с ферментом. Методами молекулярной механики были рассчитаны энергии таких взаимодействий для производных N-ацетил-!- и D-триптофана (табл.77). Значительный вклад в стабилизацию тетраэдра вносят взаимодействия в оксианионной полости фермента [3306,3307]. Если допустить, что тетраэдрическое промежуточное соединение моделирует переходное состояние реакции, то полученная разница -7,7 ккал/моль для I- и D-форм объясняет раз„шчие в скоростях ацилирования фермента стереоизомерными производными ацетилтриптофана.
Косвенные оценки константы равновесия при образовании тетраэдрического промежуточного соединения дают величину порядка 10"6 [3254]. Однако эти оценки могут преуменьшать стабильность тетраэдра, особенно для специфических субстратов.
7.8. Перенос протона и распад тетраэдрического промежуточного соединения
Распад тетраэдрического промежуточного соединения (или реакция) может происходить лишь в том случае, если уходящий амин присоединит протон. Уход амина в виде аниона невозможен из-за очень высокого значения рКа сопряженного основания:
О
11 .
-> R-С—ОН + R‘nh2 + ®NHR4
В неферментативных условиях распад тетраэдрических промежуточных соединений каталипируется общими кислотами. Такой же катализ должен наблюдаться и в случае ферментативного гидролиза.
У сериновых и цистеиновых амидгидролаз донором протона является сопряженная кислота имидазола (Hls57 у химотрипсина) - имидазолий-катион [2350]. Следовательно, необходимо допустить синхронную атаку гидроксил-ионом и перенос протона на имидазол с последующим перемещением протона от имидазолий-иона на уходящую группу:
R 0/
_с<?° Np _ Е~°У А_0 _______________> _с/> \---- R-L-о- _________>
Nr... Анн- Nr....mora
оу
_____, _ff° \-1 R-i-0“.*
N)-----HN^ H^R.
Возникает вопрос, не может ли протон быть перенесен прямо с серинового
О©
I
R—С—ОН
NHR1
О0 R—С—ОН ®NH2R‘ О
R—й—ОН
гидроксила на уходящую группу. Выше было показано, что такой процесс в предпереходном состоянии невозможен (см. разд.7.7). Это обусловлено, главным образом, большим различием в рК& спиртового гидроксила и амидного азота. В соответствии с уравнением (14) (см. разд.3.3.3), скорость такого переноса должна быть:
lgfe - 10 -[13,5-(-2,5)] = -5,5,. т.е. гг—3-10_б М-1С-1.
Однако очевидно, что по мере образования тетраэдрического промежуточного соединения рКа атома азота уходящей группы будет увеличиваться. Как было показано выше (см. разд.7.6), атака спиртовой группой карбонильного углерода субстрата не может завершиться образованием ковалентной связи без отрыва
О
протона и достигает равновесного О-С-расстояния *1 ,6 А, которое соот-
о
ветствует степени пиримидализации амидной группы Ac«0,23 А. При этом значении, как показывают расчеты, величина рйа уходящей группы составит около
