Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичным образом, по-видимому, происходит атака субстрата тиолат-ионом в цистеиновых протеазах. Интересно отметить, что "искусственный” фермент тиолсубтилизин неактивен в отношении специфических субстратов, но скорость деацилирования арилакрилоилпроизводных (полученных ацилирсванием по SH-группе арилакрилоилимидазолами) выше, чем скорость деацилирования ацкл субтилизинов [32691. Эту особенность объясняют более низкой нуклеофильнос-тью тиолат-иона по сравнению с оксо-анионсм, однако причины могут быть значительно сложнее [3270].
У аспартатных протеаз нуклеофильным агентом служит молекула воды. Крайне низкая нуклеофильность воды практически исключает эффективную атаку ре-зонансно-стабиллзированной амидной группы. В то же время ионизация путем переноса протона на карбоксилат-ион - процесс термодинамически невыгодный и может происходить лишь с очень низкой скоростью. Поэтому перенос протона и нуклеофильная атака дс-жны происходить синхронно, в едином элементарном
Положение здесь в принципе аналогично положению в сериновых протеазах с той только разницей, что имидазол является более эффективным акцептором протона, чем карбоксилат-ион. Во всех случаях синхронного элементарного акта необходимо, по-видимому, учитывать величину коэффициента синхронизации (см. разд.3.4.9), который ограничивает число возможных синхронных перемещений тяжелых атомов в одном элементарном акте. Оценить эту величину для ферментативных процессов указанного типа довольно трудно, поскольку неизвестна величина энергии активации синхронного процесса. При Ес=О максимальное число атомов, участвующих в синхронном элементарном акте, вряд ли может быть больше восьми [3271,3272].
Существует в принципе другая возможность, базирующаяся на изучении общего основного катализа в модельных соединениях [3273-3275], когда нуклеофильная атака и перенос протона проходят через два последовательных пере -
РИС.110. Движение протона по поверхности потенциальной энергии при общем основном катализе присоединения воды к карбонильной группе [3275]
ходных состояния (рис. 110). Определяющее скорость всего процесса присоединение воды, облегчаемое дестабилизацией расщепляв- к. мой группы, не сопряжено с переносом протона на общее основание. Возникающее при этом первое переходное состояние характеризуется наличием водородной связи с общим основанием. Дальнейшее движение ну;слеофила по координате реакции приводит ко второму переходному состоянию, где завершено образование нормальной связи нуклеофила с кер&мдмьным углеродом, а протон, двигаясь также по координате реакции (так как он связан с общим основанием), оказывается на "полпу-ти" к акцептору. Реакция завершается быстрым переносом протона на общее основание. Этот механизм согласуется с наблюдаемым кинетическим изотопным эффектом растворителя, так как cjnrecгеенной его особенностью является наличие Н-связи нуклеофила с общим основанием.
Если npai ильны представления о том, что в металлзависимых протеазах нуклеофилом является координированная с ионом Zn2+ вода и в координационную сферу металла входит карбонильный кислород субстрата, то у этих ферментов не возникает проблем, связанных с ионизацией нуклеофила и поляризацией карбонильной группы. Возможно., именно поэтому в фермечт-ингибиторных комплексах металлзависимых протеаз пирамкдэлизация амидной группы менее существенна, чем в сериновых ферментах.-
Квантово-химкческие..исследования 13276] показывают, что атом цинка может играть роль не только в поляризации карбонильной грхщш, но и в стабилизации промежуточного тетраэдрического соединения, неМрализуя возникающий от-рицатб льный заряд и делая связи с центральным атомом углерода более прочными.
7.7. Промежуточное тетраэдрическое соединение
Нуклеофильная атака на карбонильный углерод субстрата завершается образованием тетраэдрического промежуточного соединения. Эти промежуточные соединения были идентифицированы при неферментативном гидролизе, главным образом, на основании результатов опытов по включению 180 из тяжелокислородной воды в субстрат (см. разд.3.3.2).
Р. пьтернативным механизмом, не включающим образование тетраэдрического аддукта, является механизм типа SJ?2:
R
R
HjT'b)
—АН^ NHR4
—X— С=0 —A- NH2R4
Выбор мевду этими механизмами в случае ферментативного гидролиза достаточно сложен. Так, попытки обнаружить включение 180 в субстрат в ходе химо-трипсинового катализа, что свидетельствовало бы об образовании тетраэдрического промежуточного соединения, оказались безуспешными [3225]. Однако отрицательный результат здесь может свидетельствовать лишь о неблагоприятном соотношении скоростей fe_2 и &3:
Е-ОН
^ к ^ k ^ k У
+ i=0 , в- ~ E-OH.Lo ^^ E-O-i-O"------------------- E-0-C-R.
I I k pi +
NHR' NHR' NHR' +
NHgR'
В этом случае наблюдаемая константа скорости образования ацилфермента *2
